降鈣素基因相關(guān)肽經(jīng)鼻給藥進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)及促腦梗死修復(fù)的實(shí)驗性研究

吳慶建，閆承軍，宋大慶，劉云海，孫樹印

（濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院急診內(nèi)科，山東濟(jì)寧272011）

降鈣素基因相關(guān)肽經(jīng)鼻給藥進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)及促腦梗死修復(fù)的實(shí)驗性研究

吳慶建，閆承軍，宋大慶，劉云海，孫樹印

（濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院急診內(nèi)科，山東濟(jì)寧272011）

目的尋找快速、便捷有效的靶向中樞給藥方法，為腦梗死治療提供新的思路。方法線栓法制作大鼠大腦中動脈閉塞（Middle cerebral artery occlusion，MCAO）腦缺血再灌注模型，采用ELISA法測定經(jīng)鼻（IN）和靜脈（IV）注射CGRP后30 min時，各腦區(qū)的CGRP濃度，并觀察IN和IV給予CGRP對局灶性腦梗死的治療效果。結(jié)果IN給藥組腦部各區(qū)域、頸髓和腦脊液（Cerebro－spinal fluid，CSF）中CGRP濃度較IV組顯著增高（P＜0.01），與IV組相比較，IN給藥組梗死體積減小，腦血流量增加（P＜0.01）。結(jié)論CGRP經(jīng)鼻靶向中樞給藥可以避開血腦屏障阻礙，并對大鼠局灶性腦梗死有預(yù)防和保護(hù)作用。

降鈣素基因相關(guān)肽；經(jīng)鼻；腦梗死；神經(jīng)保護(hù)藥；中樞神經(jīng)系統(tǒng)

血腦屏障（BBB）是保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要結(jié)構(gòu)，由腦部微血管系統(tǒng)的毛細(xì)血管內(nèi)皮、基底膜、內(nèi)皮間緊密連接、角質(zhì)細(xì)胞突起、足細(xì)胞所組成，阻擋有毒有害物質(zhì)向腦部轉(zhuǎn)運(yùn)，保障中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能。其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了大分子藥物，如重組蛋白、基因治療相關(guān)藥物、多肽、單克隆抗體等都無法從血液循環(huán)穿越血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)［1］，高達(dá)95%的藥物靜脈給予時，被BBB阻擋住。Liu等［2］研究表明降鈣素基因相關(guān)肽（Calcitonin generelated peptide，CGRP）對局灶性腦梗死后腦損傷起到保護(hù)作用，但CGRP的相對分子量為3 786.91，其大分子特性，使其經(jīng)外周給藥，如經(jīng)靜脈或肌肉注射無法透過血腦屏障到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)。國外學(xué)者曾報導(dǎo)腦池內(nèi)應(yīng)用CGRP［3，4］，但由于可能發(fā)生致命性副作用，腦池注射不能成為臨床的常規(guī)用藥途徑。如何使CGRP通過臨床易于應(yīng)用的途徑繞過血腦屏障的阻礙，更有效地進(jìn)入腦脊液和腦組織，是神經(jīng)病學(xué)研究領(lǐng)域?qū)W者面臨的重要挑戰(zhàn)之一。

經(jīng)鼻給藥是一種非侵入性的中樞給藥方式，其安全、便捷、靶向性強(qiáng)，藥物可以較快在腦部達(dá)到治療濃度且可避免全身用藥可能帶來的副作用［5，6］。本研究試圖對比IN和IV給予CGRP在腦部的分布情況，探討CGRP經(jīng)鼻靶向中樞的可行性，并觀察IN和IV CGRP對大鼠局灶性腦梗死的療效。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗動物和分組 山東魯抗動物實(shí)驗中心提供健康雄性SD大鼠32只（許可證號：SCXK魯20050017），體重230～300 g，隨機(jī)分為正常對照組、IN CGRP組、IV CGRP組和IN媒介液對照組，每組8只。

1.2 實(shí)驗試劑與儀器 大鼠CGRP ELISA檢測試劑盒（武漢中美科技有限公司；大鼠CGRP（1 mg，購自美國Sigma公司，批號：015－09）；PBS粉劑（北京中杉生物技術(shù)有限公司）；其他試劑均為分析純。電子分析天平（上海天平儀器廠，JA－31001型）；高速低溫離心機(jī)（美國Sigma公司，3K30型）；切片床（德國LEICA CM 1900型）；激光多普勒血流量測量儀（瑞典，PeriFlux System PF5001型）；微量注射器（無錫市東風(fēng)玻璃儀器廠，320222YHBA 01型）。

1.3 大鼠皮層梗死區(qū)周圍缺血半暗帶腦血流量的監(jiān)測 各組動物分別于再灌注后24 h，麻醉動物，立體定位儀固定頭部，常規(guī)消毒，頭正中切口，逐層分離，暴露完整的顱骨，取頭部中線旁2 mm，冠狀縫前1 mm處鉆開一骨窗至硬腦膜，激光多普勒血流量測量儀測定皮層腦血流量。

1.4 MCAO腦缺血再灌注模型的制作 參照吳遠(yuǎn)華等［7］的改良線栓法大鼠腦缺血再灌注模型的制作方法，3%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，取頸前皮膚正中切口，分離左側(cè)頸總（CCA）、頸外（ECA）、頸內(nèi)動脈（ICA），縫合線暫時阻斷CCA和ICA血流，將預(yù)先準(zhǔn)備好的栓線插入ICA直至阻斷大腦中動脈（MCA）起始端，尼龍線插入的深度19～22 mm。大腦中動脈阻斷后60 min，將尼龍線輕輕退至CCA予以再灌注。手術(shù)過程中采用肛表電熱毯反饋裝置將大鼠體溫維持在37℃。

1.5 經(jīng)鼻給藥方法 大鼠麻醉狀態(tài)下，取仰臥位，頸背部墊高以有利于藥物進(jìn)入后鼻腔。各組與再灌流后，經(jīng)鼻腔插入與微量注射器相連的硅膠管，分別給予CGRP 1μg（溶于50μL媒介液中）。兩側(cè)鼻孔交替給藥，單次給藥量為5μL，間隔時間2 min，每只大鼠給予10次，20 min內(nèi)給予總量為50μL的藥液。

1.6 ELISA檢測各腦區(qū)CGRP濃度 經(jīng)鼻給藥結(jié)束后30 min，過量麻醉處死大鼠后，取完腦脊液后，斷頭取腦，分別取嗅球、腦橋、頸髓、皮質(zhì)、海馬，電子天平稱重后置于－85℃低溫冰箱中備用。按W∶V（g∶mL）＝1∶20的比例加入PBS緩沖液進(jìn)行組織勻漿，將組織勻漿液15 000 rpm離心30 min，完畢后取上清液。ELISA測定方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 紅四氯氮唑（TTC）染色測定腦梗死體積 4只大鼠行腦血流量檢測后，過量麻醉后斷頭處死，迅速取出腦組織，冰生理鹽水沖洗表面血跡，－20℃冰凍腦組織10 min，將腦放置于切片床上，在視交叉處開始，切成厚度約2 mm的冠狀腦切片，共6個層面，立即置于2%TTC溶液中，37℃恒溫孵育避光染色20 min，染色后放入4%多聚甲醛溶液中固定6 h。采用計算機(jī)病理圖像采集系統(tǒng)，6個層面的梗死面積之和×2 mm即為腦梗死體積（MV），并計算左右半球體積（LV、RV）。為糾正腦水腫對腦梗死體積的影響，采用Swanson等［8］應(yīng)用的以下公式計算梗死體積：梗死體積（%）＝［LV－（RV－MV）］／LV ×100%。

2 結(jié)果

2.1 CGRP在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的定量分析 表1顯示了IN或IV CGRP在中樞神經(jīng)系統(tǒng)各部位及腦脊液中的濃度分布。IN給藥組腦部各分區(qū)、腦脊液及頸髓中的CGRP濃度要高于IV給藥組，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 CGRP經(jīng)鼻給藥對腦梗死體積的影響 腦缺血再灌注24 h后，IN－CGRP組腦梗死體積為26% ±12%，IN媒介液組腦梗死體積為48%±9%，即IN－CGRP治療能夠顯著減輕44%的腦梗死體積（P＜0.01），IV CGRP組的腦梗死體積為41%±9%，與IN CGRP組比較差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），經(jīng)鼻給藥組較經(jīng)靜脈給藥組腦梗死體積顯著降低。

表1 不同途徑給予CGRP后各腦區(qū)CGRP濃度（pg·g－1）

2.3 大鼠缺血半暗帶局部腦血流量（rCBF）的變化

制作模型后，模型組rCBF均明顯降低，與正常對照組相比較具有顯著差異（P＜0.01）。24 h后，從表2可以看出，IN CGRP組腦血流顯著多于IV CGRP組，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 CGRP經(jīng)鼻給藥對rCBF的影響（±s，n＝8）

表2 CGRP經(jīng)鼻給藥對rCBF的影響（±s，n＝8）

注：與正常對照組比較，aP＜0.01；與IN CGRP組比較，bP＜0.01；與IV CGRP組比較，cP＜0.01

＜0.01組別93.1±2.6 IN CGRP組 70.1±4.3aIV CGRP組 60.5±3.7abIN媒介液組 49.3±1.2abcF 412.13 P rCBF正常對照組

3 討論

由于BBB的存在，蛋白多肽和基因藥物難以到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)達(dá)到有效的治療濃度，而腦室注射、延髓等創(chuàng)傷風(fēng)險較大的給藥方式，再加上手術(shù)的創(chuàng)傷、功能損傷和感染等不良并發(fā)癥，在臨床治療中難以成為常規(guī)的給藥途徑。近年來許多學(xué)者研究證明，許多藥物（如）經(jīng)鼻給藥可繞過BBB的阻礙，進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，中樞靶向性強(qiáng)，且具有無創(chuàng)、給藥量少、生物利用度高、無肝臟首過效應(yīng)、吸收快等優(yōu)點(diǎn)［9］。因此，經(jīng)鼻靶向中樞給藥途徑受到越來越多神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域?qū)W者的關(guān)注。

本研究結(jié)果表明，經(jīng)鼻靶向中樞給予CGRP可迅速到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)各區(qū)域，且經(jīng)鼻給藥途徑在腦部各區(qū)、頸髓、腦脊液中的CGRP濃度顯著高于靜脈給藥組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。由此可見，鼻腔和腦之間存在著可避開BBB的快速的給藥通路。鼻腔根據(jù)功能可分為鼻前區(qū)、嗅區(qū)和呼吸區(qū)，嗅覺區(qū)分布著嗅細(xì)胞，其中樞突形成無髓的嗅神經(jīng)纖維，向上穿行在黏膜下層形成嗅絲，穿過篩孔與嗅球相連［10］。當(dāng)藥物如CGRP鼻腔給藥后便可以通過嗅神經(jīng)通路被遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，如腦脊液、頸髓、大腦、腦干、小腦等部位，發(fā)揮治療作用。

迄今研究證明，CGRP是舒張血管作用最強(qiáng)的內(nèi)源性活性多肽，體外實(shí)驗研究證明CGRP可拮抗內(nèi)皮素引起的血管收縮，且作用時間持久［11］。眾多臨床研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死早期，體內(nèi)CGRP和內(nèi)皮素平衡失調(diào)，CGRP顯著降低，內(nèi)源性CGRP耗竭加重了腦缺血及腦損害，不利于神經(jīng)細(xì)胞功能恢復(fù)［12］。提示若給予外源性CGRP，在腦損傷區(qū)或中樞神經(jīng)系統(tǒng)形成較高濃度，可大大提高CGRP對腦損傷的保護(hù)效應(yīng)。本研究結(jié)果證實(shí)，大鼠局灶性腦缺血后，經(jīng)鼻給予CGRP可顯著減少腦梗死體積高達(dá)44%，且有效增加缺血半暗帶的血流量。而經(jīng)靜脈給予同劑量的CGRP未能顯示出對腦梗死的明確治療效果，表明CGRP經(jīng)靜脈給藥不能避開BBB的阻斷，進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

由此可見，CGRP經(jīng)鼻靶向中樞給藥的方法具有安全、無損傷、快速、靶向性強(qiáng)的特點(diǎn)，可以較快在腦部達(dá)到治療濃度且可避免全身用藥可能帶來的副作用。因此，CGRP經(jīng)鼻靶向中樞給藥可能成為一條有效的治療腦缺血損傷或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新途徑，其確切的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制尚有待進(jìn)一步闡明。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，CGRP經(jīng)鼻給藥腦梗死大鼠后，能夠修復(fù)腦梗死組織的損傷，這為CGRP治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了新的思路。

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The experimental study of calcitonin gene－related peptide intranasal adm inistration to central nervous system and prompt the repair of cerebral infarct

WU Qing-jian，YAN Cheng-jun，SONG Da-qing，LIU Yun-hai，SUN Shu-yin
（Department of Emergency，Jining No.1 People′s Hospital，Jining 272011，China）

ObjectiveTo develop a convenientand effectivemethod for delivering CGRP to the central nervous system bypassing the blood－brain barrier（BBB），and to explore whether it had preventive and protective effects on cerebral infarction in rats.MethodsThe MCAOmodelwasmade by nylon strand.CGRP concentration wasmeasured IN and IV injection of CGRP after30min in differentbrain areas using enzyme－linked immunosorbentassay（ELISA），and explored the treatment IN and IV CGRP in ratswith focal cerebral infarction.ResultsCGRP demonstrated amuch higher delivery of IN than IV CGRP to the brain regions.Intranasal administration CGRP had significant preventive and protective effect to focal cerebral infarction which showed the brain infarction decreased and cerebral blood flow increased（P＜0.01）.ConclusionCGRP intranasal administration targeting central administration can avoid the blood－brain barrier block，and had preventive and protective effects on the rats with focal cerebral infarction.Intranasal administration CGRP had definite preventive and protective effect to focal cerebral infarction in rats.

Calcitonin gene related peptide；Intranasal administration；Cerebral infarction；Neuroprotective agents；Central nervous system

R965

A

2095－5375（2014）08－0441－004

2010年濟(jì)寧市科技局立項課題（No.濟(jì)科字［2010］85號－24）

吳慶建，男，研究方向：腦血管危重癥救治，E－mail：wqw110＠163.com

孫樹印，男，主任醫(yī)師，研究生導(dǎo)師，研究方向：內(nèi)科危重癥救治，Tel：0537－2256996，E－mail：13615372866＠163.com