門冬氨酸鉀對局灶性腦缺血再灌注大鼠的保護(hù)作用研究

顧漪，趙育梅，龔磊，于航，王擁軍，張亞卓

凋亡是缺血性細(xì)胞死亡的常見模式[1]，是引起細(xì)胞皺縮，脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）損傷及最終的吞噬性死亡的一系列明顯的形態(tài)學(xué)和生化學(xué)改變。多種外源性和內(nèi)源性刺激均能觸發(fā)凋亡，而K+外流的增加被證明是早期凋亡性細(xì)胞皺縮和下游Caspase酶激活以及DNA片段化的重要介質(zhì)[2]。鉀離子是細(xì)胞內(nèi)重要的陽離子，參與大量酶促反應(yīng)和肌肉收縮過程。研究顯示門冬氨酸對細(xì)胞有很強(qiáng)的親和力，并能增加K+內(nèi)流[3]。本研究旨在觀察門冬氨酸鉀（potassium aspartate，PA）對大鼠局灶性腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡是否有保護(hù)作用，從而為K+在缺血性腦血管病的治療提供轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象和分組 研究采用雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重300～330 g［北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號SCXK（京）2012-0001。PA：原料藥，每瓶5 g（批號100602），遼寧藥聯(lián)制藥有限公司］。

采用線栓法制作右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，缺血2 h，再灌注22 h，制模成功的50只大鼠隨機(jī)分為PA 10 mg/kg組、PA 25 mg/kg組、PA 62.5 mg/kg組、PA 125 mg/kg組和溶劑對照組。在缺血造模后1 h按1 ml/kg給藥體積腹腔注射給予各組藥物，溶劑對照組給予生理鹽水（批號11033042，天津藥業(yè)焦作有限公司）。各組大鼠在制模成功后24 h麻醉處死取腦，行氯化2，3，5-三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色，比較各組的腦梗死體積。

另取制模成功的32只大鼠隨機(jī)分為生理鹽水組（1 ml/kg）和門冬氨酸鉀組（62.5 mg/kg），另外設(shè)立假手術(shù)組16只，每組藥物均在缺血后1 h經(jīng)腹腔注射給藥（藥物劑量為1 ml/kg），假手術(shù)組給予生理鹽水（1 ml/kg）。制模成功后24 h麻醉處死取腦，比較3組腦組織的三磷酸腺苷（adenosine-triphosphate，ATP）、乳酸含量以及細(xì)胞凋亡情況。

1.2 制模方法和成功標(biāo)準(zhǔn) 按400 mg/kg劑量腹腔注射10%水合三氯乙醛膠漿（北京天壇醫(yī)院制劑，京藥制字H20083287）麻醉，以仰臥位放置在37℃恒溫板上。采用線栓法制作右側(cè)MCAO模型[4]。具體方法為，在手術(shù)顯微鏡下經(jīng)頸正中切口，暴露雙側(cè)頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。線栓經(jīng)頸外動(dòng)脈斷端進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，向內(nèi)延伸約20 mm直到感到抵觸感，此時(shí)線栓的頭部越過大腦中動(dòng)脈的起始端，并阻斷大腦中動(dòng)脈的血流。腦缺血2 h后線栓被拔出至頸外動(dòng)脈的斷端，再灌注22 h。假手術(shù)組線栓在頸外動(dòng)脈斷端處被結(jié)扎，不再向頸內(nèi)動(dòng)脈延伸，其余手術(shù)過程與另兩組相同。術(shù)后4 h按照Schmid-Elsaesser等[5]使用的神經(jīng)行為評分法進(jìn)行評分，評分1～4分造模成功。將造模成功的大鼠納入研究，造模失敗的大鼠去除，重新造模補(bǔ)充。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 神經(jīng)功能行為評分 在腦缺血后24 h，采用Schmid-Elsaesser等使用的行為評分方法，對各組動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)功能行為的評分[5]。評分標(biāo)準(zhǔn)為，0分：無自發(fā)活動(dòng)；1分：行走時(shí)自發(fā)向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)；2分：拉尾行走時(shí)向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)；3分：向?qū)?cè)側(cè)推時(shí)抵抗能力降低；4分：提尾懸空時(shí)對側(cè)前肢屈曲；5分：無神經(jīng)功能缺損癥狀。

1.3.2 TTC染色及梗死體積測量 缺血后24 h，動(dòng)物按400 mg/kg劑量腹腔注射10%水合三氯乙醛膠漿麻醉后，斷頭處死。迅速取出腦組織，檢查并確定沒有蛛網(wǎng)膜下腔出血。將腦組織切為2 mm厚的冠狀切片，在37℃水浴中與1%TTC（Sigma-Aldrich，美國）溶液避光孵育20 min，再于10%甲醛溶液中固定10 min。將TTC染色后的6張腦片照相后保存，以進(jìn)行損傷區(qū)域的測量。采用圖像分析系統(tǒng)（HMIAS-2000，北京空海科技發(fā)展公司）計(jì)算未被TTC染色的區(qū)域，即腦缺血損傷區(qū)域?？偣Ｋ荔w積的計(jì)算方法為6張腦片未染色的面積總和乘以腦片厚度。

1.3.3 腦組織收集和處理 腦缺血后24 h，動(dòng)物以10%水合氯醛麻醉，斷頭處死，迅速取出腦組織。留取距額極前端3 mm的冠狀腦片，腦片厚度為4 mm，然后在中線右側(cè)2 mm處縱形切開，留取右側(cè)半球的腦組織[6]。所留的腦組織進(jìn)行勻漿，用于相應(yīng)的檢測。組織蛋白含量的測定使用考馬斯亮藍(lán)法。每組隨機(jī)取10只大鼠進(jìn)行腦組織ATP和乳酸的含量測定。其余每組6只大鼠斷頭處死后，腦組織以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片后用于末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸缺口末端標(biāo)記（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated 2’-deoxyuridine 5’-triphosphate nickend labeling，TUNEL）檢測。

1.3.4 腦組織ATP和乳酸含量的測定 腦組織ATP和乳酸含量的測定分別使用ATP檢測試劑盒和乳酸檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

ATP含量測定步驟為：設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)管、標(biāo)準(zhǔn)空白管、測定管和對照管，標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)準(zhǔn)空白管加入30 μl 1 mmol/L ATP標(biāo)準(zhǔn)液，測定管和對照管加入30 μl待測樣本；依次加入底物液Ⅰ，底物液Ⅱ，于標(biāo)準(zhǔn)管和測定管中加入促進(jìn)劑，標(biāo)準(zhǔn)空白管和對照管中加入蒸餾水，使反應(yīng)總體積為360 μl，混勻后37℃水浴30 min；再加入沉淀劑50 μl，充分混勻后，4000 rpm離心5 min；取各管上清液300 μl，加入顯色液500 μl，混勻，室溫靜置2 min；加入終止劑500 μl，混勻，室溫靜置5 min；使用TECAN Infinite M200酶標(biāo)儀，于波長636 nm處測定吸光度值。

乳酸含量測定步驟為：于空白管加入10 μl蒸餾水，標(biāo)準(zhǔn)管加10 μl 3 mmol/L乳酸標(biāo)準(zhǔn)液，測定管加10 μl待測樣本；依次加入酶工作液0.5 ml和顯色劑0.1 ml，混勻，37℃反應(yīng)10 min；加入終止液1 ml，混勻；用酶標(biāo)儀于波長530 nm處測定吸光度值。

1.3.5 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 每只大鼠取第一軀體感覺皮質(zhì)區(qū)的3張切片，使用原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（No.11684817910，羅氏診斷產(chǎn)品有限公司，德國）進(jìn)行分析。8 μm厚的冠狀切片經(jīng)脫蠟、復(fù)水后用蛋白酶K（10 μg/ml）室溫孵育30 min。在每個(gè)樣本上加入50 μl TUNEL反應(yīng)混合液，37℃避光反應(yīng)60 min。切片使用過氧化物酶轉(zhuǎn)換劑和3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）底物顯色，蘇木精復(fù)染后，光鏡觀察。每個(gè)樣本在梗死灶周邊區(qū)隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野進(jìn)行TUNEL陽性細(xì)胞的計(jì)數(shù)，結(jié)果以10個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)的平均值表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 神經(jīng)功能行為評分的數(shù)據(jù)為偏態(tài)分布，以中位數(shù)和四分位數(shù)表示，其他數(shù)據(jù)為正態(tài)分布，以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（ ±σ）表示。神經(jīng)功能行為評分的數(shù)據(jù)用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)分析，其余各組之間比較采用單因素方差分析以及Dunnett和S-N-K檢驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 門冬氨酸鉀對局灶性腦缺血再灌注后梗死體積的影響 不同劑量門冬氨酸鉀組和溶劑對照組大鼠的神經(jīng)功能行為評分之間差異有顯著性（KW=26.59，P＜0.001）（表1）。與溶劑對照組比較，62.5 mg/kg劑量的門冬氨酸鉀能提高大鼠的神經(jīng)功能行為評分（P＜0.001）；門冬氨酸鉀10 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg劑量組的神經(jīng)功能行為評分與對照組差異無顯著性，門冬氨酸鉀各劑量組的神經(jīng)功能評分兩兩比較差異無顯著性。各組大鼠的梗死體積之間差異有顯著性（F=3.429，P=0.016）（表1），Dunnett檢驗(yàn)顯示與溶劑對照組相比，25 mg/kg（q=2.630，P=0.040）和62.5 mg/kg（q=3.128，P=0.011）劑量的門冬氨酸鉀能降低缺血大鼠的腦梗死體積。10 mg/kg和125 mg/kg劑量門冬氨酸鉀組的梗死體積也小于溶劑對照組，但無顯著性差異；門冬氨酸鉀各劑量組的梗死體積兩兩比較差異無顯著性。圖1為大鼠局灶性腦缺血再灌注后的腦組織TTC染色圖。

2.2 門冬氨酸鉀對腦組織ATP和乳酸含量的影響 門冬氨酸鉀、溶劑對照和假手術(shù)3組大鼠的腦組織ATP含量差異有顯著性（F=6.701，P=0.004）（表2），S-N-K檢驗(yàn)顯示溶劑對照組大鼠的ATP含量低于假手術(shù)組（q=5.139，P=0.001），而與溶劑對照組相比，門冬氨酸鉀能提高腦組織的ATP含量（q=3.116，P=0.036），門冬氨酸鉀組與假手術(shù)組差異無顯著性。3組大鼠的腦組織乳酸含量差異有顯著性（F=4.341，P=0.023）（表2），S-N-K檢驗(yàn)顯示與假手術(shù)組比較，溶劑對照組（q=3.942，P=0.010）和門冬氨酸鉀組（q=3.142，P=0.035）大鼠的乳酸含量均明顯升高；門冬氨酸鉀組的乳酸含量低于溶劑對照組，但兩組之間差異無顯著性。

2.3 門冬氨酸鉀對腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL陽性細(xì)胞為細(xì)胞核出現(xiàn)致密的標(biāo)記，并顯示出凋亡的形態(tài)學(xué)特征（圖2）。在溶劑對照組大鼠的右側(cè)軀體感覺皮質(zhì)區(qū)可見大量黃褐色的TUNEL染色陽性細(xì)胞（圖2），而假手術(shù)組TUNEL染色為陰性（圖2A）。3組大鼠的凋亡陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)值差異有顯著性（F=413.1，P＜0.001）（表3），S-N-K檢驗(yàn)顯示與假手術(shù)組比較，溶劑對照組（q=40.38，P＜0.001）和門冬氨酸鉀組（q=27.94，P＜0.001）的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)均增加；與溶劑對照組相比，給予門冬氨酸鉀處理后能減少缺血后24 h的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)（q=13.91，P＜0.001）（圖2）。

3 討論

表1 門冬氨酸鉀對大鼠局灶性腦缺血再灌注后神經(jīng)功能評分和梗死體積的影響

表2 門冬氨酸鉀對缺血再灌注后腦組織ATP和乳酸含量的影響

研究顯示K+過度外流和細(xì)胞內(nèi)K+缺失是細(xì)胞凋亡的早期關(guān)鍵步驟[7-8]。在正常細(xì)胞，胞漿的K+濃度在140～150 mmol/L之間，而當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生時(shí)，K+濃度將下降到70～80 mmol/L[9]。據(jù)報(bào)道，用四羥乙基銨減弱K+外流或者提高細(xì)胞外的K+濃度能減少細(xì)胞凋亡[10]。Yushmanov等[11]用組織化學(xué)成像研究發(fā)現(xiàn)在大鼠局灶性腦缺血核心區(qū)的周邊區(qū)域能觀察到典型的K+下降和Na+以最大速度增加。門冬氨酸鉀對缺血再灌注大鼠腦細(xì)胞ATP/K+含量及細(xì)胞凋亡的影響已有報(bào)道[12]，該研究發(fā)現(xiàn)大鼠局灶性缺血20 min、60 min和再灌注15 min、60 min的腦ATP和K+含量均降低，梗死灶周邊凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯增多；門冬氨酸鉀能顯著阻止腦梗死范圍擴(kuò)大，改善再灌注后腦組織能量代謝與K+狀態(tài)。

在本研究中，缺血后24 h腦組織TTC染色結(jié)果顯示，門冬氨酸鉀組動(dòng)物的梗死體積降低，特別是在25 mg/kg和62.5 mg/kg的劑量。該結(jié)果提示門冬氨酸鉀對局灶性腦缺血再灌注有保護(hù)作用。然而，在125 mg/kg劑量時(shí)，門冬氨酸鉀組僅表現(xiàn)為有降低缺血損傷的趨勢。其可能的原因是，藥物的有效劑量通常在一定范圍內(nèi)，超出該范圍的劑量可能會(huì)導(dǎo)致不同的效應(yīng)。此外，盡管125 mg/kg劑量遠(yuǎn)低于門冬氨酸鉀的半數(shù)致死量，該劑量一般不會(huì)造成對動(dòng)物和人體的毒性作用；但有研究表明細(xì)胞在高K+培養(yǎng)基中孵育能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]，這可能是125 mg/kg劑量的門冬氨酸鉀減少梗死體積的作用不如25 mg/kg和62.5 mg/kg劑量的原因。

表3 大鼠腦缺血24 h后軀體感覺皮質(zhì)區(qū)的TUNEL陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)

腦缺血后組織ATP含量的迅速下降并引起繼發(fā)性腦損傷已被證實(shí)[14]。門冬氨酸能形成草酰乙酸，參與三羧酸循環(huán)和尿素循環(huán)，生成ATP，為機(jī)體供能。在本研究中，門冬氨酸鉀能減少腦缺血后的ATP下降，這可能與門冬氨酸的作用有關(guān)。同時(shí)，我們的研究結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，溶劑對照組的乳酸含量明顯增加并有顯著性，是因?yàn)樵谌毖鯒l件下，糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸通過乳酸途徑進(jìn)一步代謝。因此，在缺血組織中，乳酸的含量應(yīng)該上升。然而，與溶劑對照組比較，門冬氨酸鉀組的乳酸含量無明顯下降，其可能原因是：腦缺血后細(xì)胞的有氧代謝迅速降低，雖然給予門冬氨酸鉀能在一定程度上減輕缺血性損傷，但大部分細(xì)胞仍處于低氧環(huán)境下，而導(dǎo)致乳酸含量增加；此外，Zilberter等[15]證實(shí)在集中的突觸活動(dòng)下葡萄糖不足以作為能量載體，乳酸能成為維持和增強(qiáng)體外腦組織有氧代謝的有效底物，該結(jié)果也支持門冬氨酸鉀組高乳酸水平的可能性。

TUNEL染色的結(jié)果表明，門冬氨酸鉀能明顯減輕大鼠缺血后軀體感覺皮質(zhì)區(qū)的細(xì)胞凋亡，提示該藥物對局灶性腦缺血再灌注的保護(hù)作用可能通過細(xì)胞凋亡的途徑產(chǎn)生，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

圖2 大鼠腦缺血24 h后軀體感覺皮質(zhì)區(qū)的TUNEL染色細(xì)胞光鏡圖（200×）

大量的神經(jīng)保護(hù)藥物在動(dòng)物的卒中研究中被證明有效，但幾乎每種藥物在進(jìn)入臨床試驗(yàn)后都以失敗告終[16]。門冬氨酸鉀作為一種電解質(zhì)補(bǔ)充劑，已在臨床治療中使用，應(yīng)該具有較好的安全性。本研究發(fā)現(xiàn)門冬氨酸鉀對大鼠局灶性腦缺血再灌注具有保護(hù)作用，這種作用可能通過細(xì)胞凋亡的途徑產(chǎn)生。但本研究仍存在不足，首先，在動(dòng)物建模方面，受條件所限，我們在研究中使用水合氯醛進(jìn)行麻醉，動(dòng)物的蘇醒時(shí)間在2 h以后，而為了在缺血早期盡早保護(hù)半暗帶并且符合臨床對缺血發(fā)生后的最早治療時(shí)間，我們的給藥時(shí)間在缺血后1 h，這樣在缺血后治療前不能進(jìn)行有效的神經(jīng)功能評分，可能對判斷大鼠是否造模成功有一定影響；今后我們將采取氣體麻醉法，這樣大鼠會(huì)快速蘇醒，能夠在缺血后采取治療前進(jìn)行評分，從而避免治療前存在的造模差異。其次，門冬氨酸鉀對細(xì)胞凋亡的影響究竟是抑制細(xì)胞凋亡還是延緩了凋亡的發(fā)生，這需要大鼠腦缺血后觀察至7 d的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。另外，門冬氨酸鉀對腦缺血后細(xì)胞凋亡的時(shí)間效應(yīng)作用也有待完善。

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