撲草凈在養(yǎng)殖水體中的生態(tài)毒理效應及其微生物降解的研究進展

張騫月，吳 偉,2*

（1.南京農業(yè)大學 無錫漁業(yè)學院，江蘇 無錫 214081；2.中國水產科學研究院 淡水漁業(yè)研究中心/中國水產科學研究院內陸漁業(yè)生態(tài)環(huán)境與資源重點開放實驗室，江蘇 無錫 214081）

0 引 言

近年來，隨著農業(yè)的栽培耕作方式趨向于規(guī)?；图s化，病蟲害防治對農藥的需求量逐年顯著增加。其中，除草劑研發(fā)、使用的頻率明顯高于殺蟲劑和殺菌劑的發(fā)展水平，約占到農藥產量的1/3[1]，是目前世界眾多農藥種類中使用量最大、施用面積最廣、毒性最高的一類藥物。除草劑的大面積推廣應用促進了精耕農業(yè)和效益農業(yè)的發(fā)展，但同時其污染效應也擴展到整個生態(tài)系統(tǒng)。由于除草劑多數(shù)具有一定的殘效期，而且可以在生物機體內富集，因此其對生態(tài)環(huán)境的影響已引起世界各國的重視。

撲草凈屬均三氮苯類除草劑，化學性質穩(wěn)定，半衰期長，難降解，容易隨著降水、淋溶和徑流的作用，由土壤遷移入水體。在20世紀70年代，撲草凈開始被用于池塘水產養(yǎng)殖中清除雜草和青苔，因此其在水體環(huán)境中具有一定的殘留量。其不僅可直接對水生植物和浮游植物的生存狀態(tài)產生顯著影響，對魚類等水生動物表現(xiàn)出一定的毒理效應，而且可通過微型生物的降解作用產生一系列具有潛在毒理效應的代謝產物。這些物質的存在都有可能通過食物鏈及食物網的傳遞對水生態(tài)環(huán)境中的各級生物造成急性、慢性或遺傳毒性，從而引發(fā)水生態(tài)系統(tǒng)中生物種群的結構和數(shù)量發(fā)生改變[2]。撲草凈應用于水產養(yǎng)殖水體中，雖然在清除水體雜草、青苔等方面取得了顯著成效，但同時給養(yǎng)殖水環(huán)境造成了嚴重的污染，因此了解撲草凈在養(yǎng)殖水體中的生態(tài)毒理效應及其微生物降解的可能性顯得尤為重要。

1 撲草凈的理化性質及其應用概況

撲草凈（prometryne），又稱撲草凈胺、捕草凈、割草佳、撲蔓盡，化學名稱為4,6-雙異丙胺基-2-甲硫基-1,3,5-三嗪，為均三氮苯類選擇性除草劑，分子式為C10H19N5S[3]，結構式為：

撲草凈純品為白色結晶，易溶于有機溶劑，20 ℃時在水中的溶解度為48 mg/L，熔點18～120 ℃，具有臭雞蛋味。工業(yè)原粉是淺灰色粉末，是一種高效低毒的內吸型除草劑。因其具有類似于苯環(huán)的結構，故化學性質穩(wěn)定，能夠長期存在于環(huán)境和生物體中，半衰期為1～3個月，在施用多年的田間可穩(wěn)定存在12～18個月，休藥期不低于500度日[4]。植物自身對撲草凈的降解十分緩慢，且撲草凈會抑制植物分泌釋放的各類生物酶的活性[5]。其作用機制是抑制植物的光合作用，妨礙糖分的形成和淀粉的積累，使植物因缺乏養(yǎng)分而死亡。在農業(yè)生產中撲草凈主要用于大豆、麥類、花生、果樹、蔬菜及水稻田等防除稗草、野莧菜、馬齒莧、車前草等1年生禾本科及闊葉草，是農業(yè)生產使用較為廣泛的除草劑；而在水產養(yǎng)殖業(yè)中主要用于清除魚、蝦、蟹、貝、海參等養(yǎng)殖水體中的絲狀藻類（青苔）、大型草類及有害藻類[6]。養(yǎng)殖池塘中水草的過度繁生會產生一系列的不利影響，如不利于拉網操作、降低水體肥度、降低池水溫度、不利于餌料的有效利用等，不少魚苗池就是因為水草的危害而養(yǎng)不了魚苗。為了割除水草，每年都得耗費大量人力物力。同樣，養(yǎng)殖池塘中的絲狀藻類（青苔）也存在著諸多危害。因撲草凈在清除水體中雜草和絲狀藻類方面有著顯著的效果，從20世紀70年代起，其在養(yǎng)殖水體中的用量快速增長，但過度的使用勢必會污染水環(huán)境和危害養(yǎng)殖生物，破壞生態(tài)平衡[7]。

2 撲草凈對養(yǎng)殖水體中水生生物的生態(tài)毒理效應

許多養(yǎng)殖池塘特別是魚種池，雜草叢生，在消耗大量養(yǎng)分的同時，夜間還會消耗大量溶氧，致使養(yǎng)殖魚種因缺氧而浮頭，因此常選用除草劑-撲草凈來解決此類問題。故撲草凈對養(yǎng)殖水體中水生動植物的生態(tài)毒理效應的研究越來越受重視。

2.1 撲草凈對養(yǎng)殖水體中水生動物的毒理效應

謝劍等的試驗表明[7]，撲草凈對凡納濱對蝦24、48、72和96 h的LC50分別為27.86、19.95、12.02和8.91 mg/L，安全濃度（SC）為0.89 mg/L；而對羅氏沼蝦24、48、72和96 h的LC50分別為33.50、23.44、16.90和13.03 mg/L，SC為1.30 mg/L。羅氏沼蝦對撲草凈的耐藥性要強于凡納濱對蝦。按毒性分級標準，撲草凈對蝦類的毒性為中毒-高毒性[8]。

據食品數(shù)據庫中的農藥基本信息顯示，撲草凈對虹鱒魚的96 hLC50為5.5 mg/L，對藍鰓太陽魚的96 hLC50為7.9 mg/L。含撲草凈的廢水對魚類的24～96 hLC50值隨著降解時間的推移而逐漸增大，即其對魚類的急性毒性逐步降低，由高毒性廢水轉變?yōu)橹腥醯榷拘缘膹U水。

撲草凈進入水體后影響到魚類食物鏈的各個環(huán)節(jié)，間接影響到魚類的生長。我國的水產養(yǎng)殖以鯉科魚類為主，濾食性的魚以浮游植物為生，草食性魚以水生植物為生，雜食性魚以底棲生物為生，但是在幼魚階段都食浮游動物。研究表明，撲草凈對枝角類-大型溞的48 hLC50為12.66 mg/L。大量使用的撲草凈僅有少部分被植物吸收，有實驗表明，在撲草凈的使用過程中，作用于靶標植物的量不超過1%，而剩余99%的除草劑則隨著吸附作用、地表徑流、雨水沖刷等方式進入水體環(huán)境中，進而會在生物體內產生富集。通過食物鏈大量蓄積于魚體內的除草劑則會直接影響魚類的生長和繁殖[9]。同時，撲草凈除草的機理是抑制植物的光合作用，其進入養(yǎng)殖水體后可間接使水體中的溶解氧減少，影響魚類的正常生活。

2.2 撲草凈對養(yǎng)殖水體中水生植物的毒理效應

藻類在水生生態(tài)系統(tǒng)中起著重要的作用。作為地球上最重要的初級生產者，據估計藻類植物每年光合同化生產的總有機碳約13.5×1010t，比陸生高等植物生產的總有機碳約高7倍多。藻類能通過光合作用，為無脊椎動物、魚類、水鳥等生物提供O2、食物。藻類在光合作用過程中放出的氧氣是水體中氧的最重要來源，以供應魚類和其它動植物的需要，其種類多樣性和初級生產量直接影響水生態(tài)系統(tǒng)的結構和功能。因此藻類的存在無論是對水體生產力還是水體污染的自凈作用均具有十分重要的意義。

藻類個體小，繁殖快，容易獲得，而且對毒物有著高度的敏感性，不同的藻類對毒物的敏感性強度存在著較為顯著的差異。當某一水體被污染時，較敏感的藻類會首先受到影響，進而消減，所以藻類是反映水體污染程度的良好指標。

黃誠等[10]試驗表明：橢圓小球藻對酰溴苯腈、辛酰溴苯胺、禾草靈、西瑪津、西草凈、撲草凈、莠滅凈、綠草定、草凈津、除草通等10種除草劑的毒性分別在第4、6、3、7、6、5、8、4、5和4天達到最大，各濃度最大抑制率范圍為：18.33%～68.46%、34.84%～70.77%、19.76%～66.07%、54.37%～98.72%、37.88%～97.77%、72.97%～98.81%、36.17%～99.75%、41.03%～97.44%、35.09%～98.58%、88.04%～95.18%；低濃度的除草劑對該藻都表現(xiàn)出一定的生長促進作用；10種除草劑對橢圓小球藻的毒性大小順序為：莠滅凈>撲草凈>西草凈>西瑪津>除草通>草凈津>禾草靈>辛酰溴苯胺>辛酰溴苯腈>綠草定。試驗中又選取了螺旋魚腥藻，類似的結果也出現(xiàn)：上述10種除草劑的毒性分別于第3、4、4、5、3、4、5、3、5和2天達到最大，撲草凈濃度最大抑制率范圍為：83.98%～95.75%；撲草凈生長促進大小范圍依次是：11.04%～36.63%；10種除草劑對螺旋魚腥藻的毒性大小順序為：莠滅凈>撲草凈>草凈津>西草凈>西瑪津>辛酰溴苯腈>禾草靈>除草通>辛酰溴苯胺>綠草定。撲草凈對螺旋魚腥藻的毒性大，但在濃度為0.02 mg/L時表現(xiàn)出高達36.63%的生長促進作用。

謝劍等[7]試驗表明，撲草凈對金魚藻的240 hEC50為0.13 mg/L，對輪葉黑藻的240 hEC50為0.02 mg/L，表明撲草凈對金魚藻的毒性要弱于輪葉黑藻。在凡納濱對蝦和羅氏沼蝦的養(yǎng)殖池塘，應用撲草凈清除金魚藻和輪葉黑藻等沉水性植物，濃度為0.02～0.89 mg/L時，效果最佳。另有試驗表明萊茵衣藻對撲草凈有一定的生物富集和生物降解作用，萊茵衣藻能顯著減少培養(yǎng)基中撲草凈含量，且對撲草凈有很強的富集能力，同時，低濃度的撲草凈會刺激萊茵衣藻的生長，而高濃度時則會產生抑制作用。李雪芹等[11]研究表明，撲草凈對蛋白核小球藻也會產生相類似的效果，在單種毒性效應下，撲草凈對蛋白核小球藻的EC50是0.164 mg/L。

水綿是一種不分枝的絲狀藻類，為雙星藻科水綿屬，常見于池塘、緩慢流動的河水中。少量的水綿在某種程度上可以起到凈化水體的作用；但大量的水綿腐爛變質后，將嚴重影響水質，破壞生態(tài)平衡，使魚蝦繁盛的水體變?yōu)橐粸场八浪?。POD和SOD為植物體內2種清除自由基的關鍵酶，在水綿受到撲草凈處理時，其濃度具有明顯變化。廖金花等[12]研究發(fā)現(xiàn)，撲草凈是通過使SOD和POD活性下降造成植物體內自由基積累，而引起對植物體的傷害。

3 撲草凈的微生物降解及其研究進展

3.1 撲草凈的微生物降解研究進展

最早關于均三氮苯除草劑的微生物降解研究報道見于1963年。Kaufman[13]利用14C標記側鏈的均三氮苯溶液進行微生物培養(yǎng)時，釋放出了14CO2，證明了均三氮苯側鏈進行了脫烷基作用。后來許多試驗表明存在于環(huán)境中的均三氮苯類除草劑在一開始會對微生物表現(xiàn)出較強的攻擊能力，因此較難降解。但是隨著環(huán)境條件的不斷變化，微生物在與除草劑長期接觸后，會增強其對除草劑的適應能力，包括自發(fā)的產生突變菌株或形成新的誘導酶系[14]，因而能夠對除草劑的降解起到明顯的效果。這些研究為撲草凈的微生物降解提供了可能的途徑。均三氮苯類除草劑生物降解不僅要受微生物種類、數(shù)量、分布、均三氮苯類除草劑濃度、分子量和化學結構的影響，還會受到環(huán)境條件如通氣狀況、溫度、濕度、營養(yǎng)條件、酸堿度所影響[15]。均三氮苯類除草劑微生物降解研究至今約50年,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種細菌、真菌、放線菌、藻類可以降解與轉化均三氮苯類除草劑。目前已發(fā)現(xiàn)能夠降解均三氮苯類除草劑的微生物達24種，其中真菌18種，細菌5種，放線菌1種。

撲草凈作為被廣泛應用的除草劑，其微生物降解研究也取得一定的進展。目前已發(fā)現(xiàn)的可降解撲草凈的微生物種屬有：假單胞菌屬（Pseudomonas）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和埃希氏菌屬（Escherichia）；頭孢霉屬（Cephalosporium），曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）和枝孢霉屬（Cladosporium）。顏慧等[16]報道了假單胞菌屬細菌FR對撲草凈的降解率可達60%～70%左右。菌株FR對撲草凈的降解是誘導性的，它對撲草凈降解的最適環(huán)境條件為pH7.0，32 ℃。

大量研究表明，微生物在降解殘留于環(huán)境的除草劑中發(fā)揮了重要的作用，微生物降解是目前治理殘留除草劑污染的有效手段之一，利用微生物及其降解酶對環(huán)境中殘留的除草劑進行凈化處理已顯示出良好的應用前景[17]。

3.2 微生物對撲草凈的降解途徑

微生物對撲草凈的降解機理主要是通過其分泌的酶的代謝來完成，其本質為酶促反應，包括：廣譜性酶的偶然性代謝、由基質結構與撲草凈相似的酶進行的共代謝，以及由利用撲草凈作為能源的適應酶進行的降解代謝。綜合來說，撲草凈微生物降解的途徑包括氧化、還原、水解、脫鹵、縮合、脫羧、異構化等[18]。

在水生態(tài)環(huán)境中微生物對撲草凈的作用方式為兩類[19]：一是直接作用，即微生物直接作用于撲草凈，由酶促反應引起，即微生物的代謝，主要包括：（1）共代謝。撲草凈的生物降解反應就是酶促反應。在多步驟的酶促反應過程中，各種酶對底物的專一性強。底物被多步反應分解時，產生了某些中間態(tài)的化學分子，往往只是原體化合物發(fā)生的部分改變，并不能被專一性強的酶所降解。但在自然條件下，共代謝產生的中間產物往往可被其它微生物種群或物理化學因子所降解。（2）生物濃縮，即指微生物菌體細胞通過吸附和吸收的過程積聚水環(huán)境中殘留的撲草凈，撲草凈在被吸收的同時往往也可能被轉化，從而減少對環(huán)境的污染。二是間接作用，是指微生物的活動改變了周圍的環(huán)境從而間接作用于撲草凈。如微生物的作用改變了水體或沉積物微環(huán)境中的pH，降低氧化還原電位造成還原的環(huán)境，均可引起撲草凈的次生化學降解。

4 影響微生物降解撲草凈的因素

微生物降解撲草凈的速率決定于內因和外因，內因包括撲草凈本身因素和微生物本身因素，外因是環(huán)境的物理、化學及生物學條件。

撲草凈的自身結構決定了其溶解性，影響其能否被微生物所攝取。撲草凈化學結構中所含的氮、氫等原子，會降低其生物降解性，這類基團的數(shù)目越多，生物降解性越差。撲草凈的化學結構還決定了其被微生物降解的速度[20-21]。微生物的種類、數(shù)量、代謝活性、適應性等都直接影響到對撲草凈的降解與轉化，不同的微生物種類或同一種類的不同菌株對撲草凈的反應都不同。微生物具有較強的適應和被馴化的能力，撲草凈能誘導微生物產生相應的酶系來降解它，或通過基因突變等建立新的酶系來降解它。微生物自身的功能特性和變化是影響降解最重要的因素。

而像pH值、溫度、濕度、含C和N等有機質的含量、鹽度、基質的吸附作用、黏度及通氣量等環(huán)境因子，均可影響微生物對撲草凈的降解能力。pH偏酸性時，利于真菌繁殖，pH偏堿性或中性時，利于細菌繁殖。大多數(shù)微生物有最適生長溫度，降解酶也有最適反應溫度。溫度的改變可以影響微生物的代謝、降解酶的活性，甚至還能影響撲草凈的物理狀態(tài)，從而影響降解速率。在濕潤、有機質含量豐富、通氣良好的環(huán)境中，利于好氧或兼性厭氧微生物的生長，從而提高降解效率。

5 微生物降解撲草凈存在的問題

雖然微生物降解撲草凈研究已經取得了很大的進展，而且也有了一些應用的實例，但研究大多局限在實驗室中，要完全走出實驗室到實際應用中還有一段路要走，微生物降解撲草凈方面存在一定的問題：（1）單一微生物不適應自然界復雜的環(huán)境條件?，F(xiàn)階段，撲草凈的微生物降解研究主要是在實驗室單一菌種純培養(yǎng)的條件下進行的，在實驗室內獲得純培養(yǎng)的菌株，然后研究它的特性、降解機理等，這與自然生態(tài)中農藥污染的降解行為相去較遠。撲草凈往往存在于復雜環(huán)境中，自然狀態(tài)下多種微生物共存，通過微生物之間的共同作用把撲草凈降解，很可能出現(xiàn)撲草凈單一株菌的降解活性到了復雜條件下可能無法生存或起不到期望作用的情況?；钚晕⑸镌谧匀唤绲纳婺芰徒到饣钚远夹枰M一步研究，所以必須確定所篩選的菌種是否屬于常駐優(yōu)勢菌種。（2）撲草凈及其降解產物對環(huán)境的污染影響是不同的。有些劇毒農藥或除草凈，一經降解就失去了毒性；而另一些農藥或除草凈，雖然自身的毒性不大，但它們的分解產物毒性很大；還有一些，其本身和代謝產物都有較大的毒性。所以在評價撲草凈經微生物降解前后對養(yǎng)殖水體環(huán)境的污染影響時，不僅要看撲草凈自身的毒性，而且還要注意其代謝產物是否具有潛在的危害[21]。

6 微生物降解撲草凈的發(fā)展前景

目前各國科研工作者已分離出了可降解撲草凈的菌種資源，并成功構建了各種工程菌株。但是如何建立菌種資源庫，加強菌種資源和基因資源的整合，實現(xiàn)環(huán)境修復的規(guī)?；图s化，避免造成二次污染，保障生物工程菌使用安全等仍是當前面臨的重要課題。我國在養(yǎng)殖水體環(huán)境生物修復領域的研究比較領先，但是相關數(shù)據庫的建立卻非常落后。在目前農業(yè)生產對除草劑依賴程度還很高的情況下，充分發(fā)揮微生物對環(huán)境的修復潛力，整合各方面科研力量，對解決環(huán)境中的撲草凈的殘留問題具有重要的理論意義和現(xiàn)實意義。

7 結 論

隨著我國農業(yè)的快速發(fā)展，均三氮苯類除草劑在農業(yè)中的應用日益廣泛。近年來關于撲草凈的研究報道也逐年增多。撲草凈對水生動植物、兩棲類生物、哺乳動物、人類細胞等都有不同程度的損害作用，具有一定的生物毒性，達到一定濃度時能抑制多種藻類的光合作用及生長，從而引起水生生態(tài)系統(tǒng)中食物鏈的改變，影響生態(tài)平衡。

利用微生物來降解撲草凈的研究國內已取得了一定的業(yè)績，但目前仍屬探索和初步應用階段，具有十分廣闊的應用發(fā)展前景。國外許多學者的研究表明，微生物降解處理撲草凈具有物理、化學方法無可比擬的優(yōu)越性：成本低、操作條件廣泛、處理效果好等優(yōu)點，能達到對污染清潔修復的目的。隨著生物技術的發(fā)展，如何篩選和構建出高效菌株，大幅度提高微生物降解撲草凈的能力以及修復污染的水體等等仍然是專家學者們致力研究的熱點問題。

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