Nisin和檸檬酸對鮮切皇冠梨儲藏期間單增李斯特菌生長的影響

陳 晨，胡文忠，*，何煜波，姜愛麗，張瑞東

（1．大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，生物化學(xué)工程國家民委-教育部重點實驗室，遼寧省食源性病原微生物快速檢測與控制工程技術(shù)研究中心，遼寧大連 116600；2．大窯灣出入境檢驗檢疫局，遼寧大連 116600）

Nisin和檸檬酸對鮮切皇冠梨儲藏期間單增李斯特菌生長的影響

陳 晨1，胡文忠1，*，何煜波1，姜愛麗1，張瑞東2

（1．大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，生物化學(xué)工程國家民委-教育部重點實驗室，遼寧省食源性病原微生物快速檢測與控制工程技術(shù)研究中心，遼寧大連 116600；2．大窯灣出入境檢驗檢疫局，遼寧大連 116600）

分別采用0.05mg/mL乳酸鏈球菌素（Nisin）、0.3%檸檬酸復(fù)配溶液和自來水清洗接種單增李斯特菌（LM）的鮮切皇冠梨，將清洗后的鮮切皇冠梨分別于4、12、24℃的條件下儲藏，以未清洗的樣品為對照，測定儲藏過程中LM的生長情況。結(jié)果顯示Nisin和檸檬酸清洗能顯著降低（p＜0.05）鮮切皇冠梨中LM的初始帶菌量。在4℃儲藏過程中，Nisin和檸檬酸清洗的鮮切皇冠梨中LM數(shù)量沒有明顯變化（p＞0.05），自來水清洗和未清洗的鮮切樣品中LM數(shù)量略有升高。在12℃和24℃儲藏期間，三種處理方式的鮮切皇冠梨LM數(shù)量均顯著上升（p＜0.05）。Nisin和檸檬酸復(fù)配清洗處理結(jié)合低溫儲藏能有效控制鮮切皇冠梨中LM的生長。

單增李斯特菌，鮮切皇冠梨，乳酸鏈球菌素，檸檬酸，儲藏

鮮切果蔬自20世紀50年代問世后，因其品質(zhì)新鮮、營養(yǎng)衛(wèi)生和食用方便等優(yōu)點而得到較快發(fā)展。但是由于鮮切果蔬的加工操作（如去皮、切割及切片等）會使果蔬的組織結(jié)構(gòu)破壞、營養(yǎng)成分外流，極有利于微生物生長繁殖，在一定程度上降低了鮮切果 蔬 的 安 全 性[1]。 單 核 細 胞 增 生 李 斯 特 菌（Listeria monocytogenes，LM）是一種常見的人和畜共患病食源性致病菌，可以通過污染的畜禽產(chǎn)品、蔬菜、水果等食物而引起人類感染致病[2]，近年來在鮮切果蔬中常檢測出LM的存在[3-6]。由于鮮切果蔬在食用前不再進行殺菌處理，因此在鮮切果蔬加工過程中進行必要的殺菌處理和選用適宜的儲藏條件，對于保證其食品安全具有重要作用[7]。

目前在鮮切果蔬微生物控制中，含氯殺菌劑因其價格低廉、殺菌迅速而廣泛應(yīng)用，但很多含氯殺菌劑的安全性問題也不容忽視。Nisin和檸檬酸是被認為安全的（Generally Recognized as Safe，GRAS）食品抗菌劑，現(xiàn)階段利用Nisin和檸檬酸來控制鮮切果蔬中LM的研究較多[8-11]，但采用Nisin和檸檬酸復(fù)配清洗鮮切皇冠梨，探討儲藏溫度對清洗后鮮切皇冠梨中LM生長影響的研究未見報道。本文采用0.05mg/mL Nisin和0.3%檸檬酸復(fù)配溶液和自來水清洗接種單增李斯特菌（LM）的鮮切皇冠梨，將清洗后的鮮切皇冠梨分別于4、12、24℃的條件下儲藏，以未清洗的樣品為對照，研究清洗劑及儲藏溫度對鮮切皇冠梨中LM生長的影響，為探索鮮切果蔬的儲藏保鮮提供新的方法和思路。

1 材料方法

1.1 材料與儀器

皇冠梨 購于大連開發(fā)區(qū)樂購超市；LM標準菌株（ATCC19115） 遼寧省疾病控制中心；含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂（TSA-YE）、含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯（TSB-YE）、牛津瓊脂（OXA）基礎(chǔ)、牛津瓊脂（OXA）添加劑 青島海博生物技術(shù)有限公司；蛋白胨 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；乳酸鏈球菌素（Nisin） 浙江銀象生物工程有限公司；檸檬酸 為食品級。

MLS-3020型全自動高壓蒸汽滅菌器 日本SANYO公司；1300系列A2型二級生物安全柜 美國THERMO FISHER SCIENTIFIC 公 司 ；AB135-S 型 分析 天 平 瑞 士METTLER TOLEDO公 司 ；BagMixer-400W型均質(zhì)器 法國INTERSCIENCE公司；DNP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；HYC-326A型醫(yī)用冷藏箱 青島海爾特種電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原菌液的制備 在無菌室的生物安全柜內(nèi)無菌操作取標準LM菌株，在TSA-YE無菌平板上平行劃線活化，36℃培養(yǎng)24~48h后挑取單菌落接種到含有150mL無菌TSB-YE的三角瓶中，充分混勻后于36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48h，至初始菌落數(shù)大致為107cfu/mL，即原菌液，4℃保存，備用。

1.2.2 接種菌液的制備 原菌液在4℃、5000r/min條件下離心5min后，棄去上清，沉淀用0.1%蛋白胨水沖洗，重復(fù)兩次后沉淀用0.1%蛋白胨水適當(dāng)稀釋，得到濃度約為107cfu/mL的菌懸液，即接種菌液，4℃保存?zhèn)溆肹12]。

1.2.3 樣品制備 在無菌室內(nèi)，將皇冠梨用自來水洗凈后，用無菌刀將其切成約1cm×1cm×1cm的小塊，每30g鮮切皇冠梨樣品接種0.1mL接種菌液，接種后，樣品于生物安全柜中干燥30min。

1.2.4 樣品處理與儲藏 干燥后的鮮切皇冠梨分別放入含有自來水和0.05mg/mL Nisin、0.3%檸檬酸復(fù)配溶液的燒杯中，固液比為1∶5，手動攪拌浸泡5min，取出樣品置于生物安全柜內(nèi)干燥20min。將清洗干燥后的鮮切皇冠梨利用無菌均質(zhì)袋封口包裝后，分別置于（4±2）、（12±2）、（22±2）℃的溫度下儲藏。未清洗的鮮切皇冠梨作為對照在同樣的條件下儲藏。

1.2.5 單增李斯特菌計數(shù) 采用平板計數(shù)法[2]。在4℃條件下儲藏的鮮切皇冠梨分別于第0、1、2、3、4、5d取樣，在12℃和24℃條件下儲藏的鮮切樣品分別于第0、4、12h和1、2、3、4、5d取樣。將取出的樣品置于無菌均質(zhì)袋中，加入50mL 0.1%蛋白胨水，在拍擊式均質(zhì)機上連續(xù)均質(zhì)1min，上清菌懸液選擇合適稀釋度用無菌生理鹽水進行稀釋，取100μL的稀釋液涂布于牛津瓊脂（OXA）平板上，36℃培養(yǎng)48h后計數(shù)。每個處理做3個平行實驗。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行方差分析和差異顯著性檢驗，用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 4℃ 儲 藏 條 件 下 Nisin 和 檸 檬 酸 對 鮮 切 皇 冠 梨LM生長的影響

圖1 4℃儲藏條件下LM生長情況Fig.1 Fate of LM on fresh-cut pears strorage at 4℃

圖1表示Nisin和檸檬酸復(fù)配清洗以及自來水清洗后的鮮切皇冠梨在4℃條件下儲藏過程中LM的生長情況。由圖1可知，自來水清洗使鮮切皇冠梨中LM的數(shù)量與未清洗組僅下降了0.4lg cfu/g，而Nisin和檸檬酸復(fù)配清洗處理后，鮮切皇冠梨中LM的初始帶菌量與未清洗組下降了2.1lg cfu/g。在4℃條件下儲藏過程中，Nisin和檸檬酸復(fù)配清洗處理的鮮切皇冠梨中LM的數(shù)量沒有發(fā)生明顯變化（p＞0.05），而自來水清洗和未清洗的鮮切皇冠梨中LM則略有上升（p＜0.05）。

2.2 12℃ 儲 藏 條 件 下Nisin和 檸 檬 酸 對 鮮 切 皇 冠 梨LM生長的影響

由圖2所示，三種處理方式下的鮮切皇冠梨在12℃條件下儲藏過程中LM數(shù)量均顯著升高（p＜0.05）。自來水清洗和未清洗的鮮切皇冠梨中LM在儲藏過程中一直呈上升趨勢，未清洗的樣品在儲藏過程中LM的數(shù)量從初始的4.6log cfu/g（第0d）上升至5.9log cfu/g（第5d）。雖然自來水清洗能使LM的數(shù)量有所下降，但在儲藏3d后LM的數(shù)量與未清洗的樣品無顯著差異（p＞0.05）。Nisin和檸檬酸復(fù)配清洗處理的鮮切皇冠梨中LM在儲藏的最初3d內(nèi)上升了2lg cfu/g，隨后儲藏過程中LM的數(shù)量并沒有發(fā)生顯著變化（p＞0.05），儲藏至第5d時，LM的數(shù)量達到4.5lg cfu/g。在12℃儲藏過程中，Nisin和檸檬酸復(fù)配清洗處理樣品中LM的數(shù)量顯著低于自來水清洗和未清洗的樣品（p＜0.05）。

圖2 12℃條件下儲藏LM生長情況Fig.2 Fate of LM on fresh-cut pears strorage at 12℃

2.3 24℃ 儲 藏 條 件 下Nisin和 檸 檬 酸 對 鮮 切 皇 冠 梨LM生長的影響

不同處理方式的鮮切皇冠梨在24℃條件下儲藏期間LM數(shù)量的變化如圖3所示。從圖3中可以看出，未清洗樣品中LM的生長情況與自來水清洗的樣品基本一致。自來水清洗的鮮切皇冠梨儲藏5d后，LM的數(shù)量上升了2.1lg cfu/g，其中儲藏的第1d LM生長速度較快，從第2~5d，LM的數(shù)量無顯著變化（p＞0.05）。Nisin和檸檬酸復(fù)配清洗處理的鮮切皇冠梨中LM在儲藏的最初3d內(nèi)生長速度較快，隨后保持不變（p＞0.05）。儲藏5d后，LM的數(shù)量達到了4.7lg cfu/g，要顯著低于自來水清洗和未清洗樣品中LM的數(shù)量（p＜0.05）。

圖3 24℃儲藏條件下LM生長情況Fig.3 Fate of LM on fresh-cut pears strorage at 24℃

3 討論

鮮切果蔬的清洗處理是影響其微生物生長的重要因素。許多研究表明單純自來水清洗并不能控制鮮 切果 蔬中LM的生 長[13-14]，而 在 清 洗 用 水 中 加 入 殺菌劑能夠有效抑制致病微生物數(shù)量的升高。Park等[15]采用1%和2%的檸檬酸處理鮮切蘋果10min，能顯著抑制其中大腸桿菌O157∶H7、沙門氏菌和LM的生長，此外檸檬酸的處理還能降低鮮切蘋果的褐變程度。Xu等[11]研究表明，單獨使用Nisin并不能使鮮切黃瓜和生菜中的LM數(shù)量顯著降低，而當(dāng)Nisin與檸檬酸以及葡萄籽提取物復(fù)配使用時則能顯著降低LM的數(shù)量。本研究采用0.05mg/mL Nisin與0.3%檸檬酸復(fù)配溶液清洗鮮切皇冠梨5min，使LM的初始菌量下降了2.1lg cfu/g，在4℃條件下儲藏5d，LM數(shù)量沒有發(fā)生顯著變化。但是在12℃和24℃的條件下儲藏，LM生長速度較快?？赡苁且驗镹isin和檸檬酸處理使鮮切皇冠梨中內(nèi)源性微生物的數(shù)量下降，使LM失去了生長競爭抑制，從而增加了生長速度[16-17]。

儲藏溫度也是影響鮮切果蔬中微生物生長的重要因素。LM具有低溫存活生長性，可以在2～4℃條件下生長[18]。Fang等[18]研究顯示，鮮切哈密瓜中的LM可以在4℃的條件生長，接種到桃子中的LM在5℃條件下6d，數(shù)量可以增加0.5lg cfu/g[19]。但是也有一些研究表明鮮切果蔬在低溫條件下儲藏LM的數(shù)量不變或有所下降，例如Vandamma等[12]研究結(jié)果表明，鮮切芹菜在4℃的條件下儲藏7d，LM的數(shù)量下降了1lg cfu/g；綠蘆筍和鮮切生菜中LM在4℃的條件儲藏不生長[20-21]。本研究表明，Nisin和檸檬酸處理后的鮮切皇冠梨在4℃儲藏過程中LM的數(shù)量沒有發(fā)生明顯變化。這些研究結(jié)果的不一致主要與鮮切產(chǎn)品中內(nèi)源微生物的種類和數(shù)量以及鮮切產(chǎn)品的營養(yǎng)成分、pH等因素有關(guān)。隨著儲藏溫度的升高，LM的增長速度加快。Alegre等[22]將鮮切蘋果在25℃和20℃條件下儲藏2d英諾克李斯特菌的數(shù)量增長了兩個對數(shù)值，而在10℃條件下儲藏6d才能達到這一增加量，這與本研究中鮮切皇冠梨在24℃條件下儲藏LM增長的數(shù)量要高于12℃條件下儲藏的增長量的結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本研究的結(jié)果表明清洗溶液成分、儲藏溫度對鮮切皇冠梨中LM的生長均具有一定影響，Nisin和檸檬酸清洗處理結(jié)合低溫儲藏能夠有效控制鮮切皇冠梨中LM的生長。

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Effect of Nisin and citric acid on the fate of Listeria monocytogenes on fresh-cut crown pears during storage

CHEN Chen1，HU Wen-zhong1，*，HE Yu-bo1，JIANG Ai-li1，ZHANG Rui-dong2
（1.College of Life Science，Dalian Nationalities University，Key Laboratory of Biochemical Engineering，The State Ethnic Affairs Commission-Ministry of Education，Research Center of Engineering and Technology for Rapid Detection of Foodborne Microorganisms and Control，Dalian 116600，China；2.Dayaowan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Dalian 116600，China）

Sanitizer solution （0.05mg/mL Nisin+0.3%citric acid ） and tap water were separately used to wash fresh-cut crown pears inoculated with Listeria monocytogenes（LM）.Washed fresh-cut samples were stored at 4，12 and 24℃ for 5 days to determine the fate of LM during storage，unwashed samples were used as control. The results showed that washing with Nisin combined with citric acid solution significantly reduced the initial level of LM （p ＜0.05）.LM populations remained relatively unchanged （p ＞0.05 ） on sanitizer solution washed fresh-cut samples and small increased on tap water washed and unwashed samples during storage at 4℃ . When storage at 12 and 24℃ ，LM populations significant increased （p＜0.05） on the fresh-cut pears.Results indicated that washing with Nisin and citric acid combined with storage at a refrigeration temperature might be applied as an effective preservative for controlling the growth of LM on fresh-cut crown pears.

Listeria monocytogenes；fresh-cut crown pears；Nisin；citric acid；storage

TS201.3

A

1002-0306（2014）22-0326-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.063

2014－01－20

陳晨（1986-），女，博士，講師，研究方向：食品質(zhì)量與安全。

* 通訊作者：胡文忠（1959-），男，博士，教授，研究方向：采后生物學(xué)與技術(shù)。

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD38B05）；國家

自然科學(xué)基金資助項目（31172009）；大連市科技計劃項目（2012E13SF106）；大連民族學(xué)院博士啟動基金項目（0701-110014）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費項目（DC2013010107）。