脈沖強光對糙米發(fā)芽過程積累GABA條件的優(yōu)化

王 勃，馬 濤，惠麗娟，劉 賀，何余堂

（渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，渤海大學(xué)糧油科學(xué)與技術(shù)研究所，遼寧錦州 121013）

脈沖強光對糙米發(fā)芽過程積累GABA條件的優(yōu)化

王 勃，馬 濤，惠麗娟，劉 賀，何余堂

（渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，渤海大學(xué)糧油科學(xué)與技術(shù)研究所，遼寧錦州 121013）

通過脈沖強光技術(shù)促進糙米發(fā)芽過程富集GABA，并采用響應(yīng)面方法確定了其最佳處理條件：浸泡12h后，對單層糙米進行脈沖強光照射，單次能量400J、閃照次數(shù)277次、閃照距離11.3cm，此條件下發(fā)芽糙米中GABA含量可達到345.7mg/100g。

發(fā)芽糙米，GABA，脈沖強光，響應(yīng)面

糙米具有完整的生命活力，在適宜水分和溫度條件下就能發(fā)芽[1]。在糙米發(fā)芽過程中GABA在磷酸吡 哆 醛（PLP）等 輔 酶 作 用 下[2]，經(jīng) 谷 氨 酸 脫 羧 酶（GAD）催化L-谷氨酸（L-Glu）脫羧生成，而谷氨酸的生成依靠蛋白酶分解蛋白質(zhì)，然后經(jīng)谷氨酸代謝轉(zhuǎn)化得到。發(fā)芽糙米中γ-氨基丁酸（GABA）含量與GAD的活性大小呈顯著正相關(guān)[3]。在機械損傷、溫度應(yīng)激、高酸度、厭氧、干旱、黑暗和蟲害等逆境條件下，植物體內(nèi)GAD的活性升高，導(dǎo)致GABA積累，積累的GABA反過來則會刺激細胞，加大植物體對逆境的適應(yīng)，這是植物在抵抗昆蟲斗爭、組織受損和溫度脅迫等逆境中的重要應(yīng)激反應(yīng)。研究表明[4]，蟲害、擠壓、研磨等機械損傷，微波、紅外、冷凍等溫度應(yīng)激的逆境條件都會導(dǎo)致胞內(nèi)結(jié)構(gòu)破壞，使細胞質(zhì)pH降低、鈣離子水平增加，使得與CaM相關(guān)的基因表達在環(huán)境應(yīng)激中受到調(diào)節(jié)，從而激活谷氨酸脫羧酶引起GABA含量的增加。脈沖強光的波長范圍從紫外光到近紅外光，其中至少有70%的電磁能來自波長為170～2600nm的光線，具有光熱、光化學(xué)效應(yīng)[5]。脈沖強光處理脈沖電場所產(chǎn)生的物理效應(yīng)對GAD活性有促進作用，因此對富集GABA有一定促進作用。本研究在單因素實驗基礎(chǔ)上，進行響應(yīng)面設(shè)計，得出脈沖強光處理發(fā)芽糙米富集GABA最佳工藝條件，為實際生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試糙米 中稻股份有限公司，品種為遼星1號；GABA標準品 Sigma公司；谷氨酸鈉（MSG，味精，谷氨酸鈉＞99%，無鹽） 中外合資武漢味全食品有限公司；次氯酸鈉 分析純，有效氯為9%，廣東汕頭市西隴化工廠；重蒸苯酚 分析純，武漢天源生物技術(shù)有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硼砂、硼酸和無水乙醇 均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

脈沖強光表面殺菌實驗柜 寧波中物光電殺菌技術(shù)有限公司；HH.B11-500電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；HH-601A超級恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；UV1200型紫外可見分光光度計 上海正慧工貿(mào)有限公司；PB-20標準pH計 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)芽糙米的生產(chǎn)工藝流程 將精選后的糙米用1.0%的次氯酸鈉溶液浸泡5min，加入量以剛好淹沒糙米為宜，下同[6]，自來水沖洗3遍，加入4倍體積的水，30℃浸泡12h。糙米浸泡后用去離子水清洗，均勻地攤于鋪有四層紗布的培養(yǎng)皿中，其中紗布用營養(yǎng)液潤濕[7]。所用營養(yǎng)液為pH5.7的PBS緩沖溶（0.05mol/L），其中MSG濃度為2.1mg/mL。發(fā)芽過程每隔4h加入1mL營養(yǎng)液并上下翻動糙米，以保證糙米在發(fā)芽期間的濕潤狀態(tài)，31℃恒溫發(fā)芽25h。

1.2.2 脈沖強光參數(shù)介紹 工作電壓2800V，額定功率1kW，電源：AC220V±10%，內(nèi)置石英板調(diào)節(jié)照射距離，共有六個高度可以調(diào)節(jié)。樣品輻照腔規(guī)格：480（mm）×400（mm）×270（mm）。處理時，將處理樣品置于燈管正下方石英板上即可。在閃照過程中，上下翻動糙米，使其照射均勻。

1.2.3 GABA含量的測定 參考姚森[8]的方法并加以改進，取2.5g發(fā)芽糙米，加適量蒸餾水研磨勻漿，然后定容至50mL，于30℃水浴中浸提2h，過濾后取濾液0.5mL，加入0.2mL 0.2mmol/L硼酸緩沖液（pH9.0），1mL 6g/100mL重蒸苯酚溶液，0.4mL有效氯含量9%的NaClO溶液，充分振蕩，置于沸水浴10min，再立即置于冰水浴中20min并不斷振蕩，待溶液出現(xiàn)藍綠色后，加2mL體積分數(shù)60%的乙醇溶液，再次振蕩均勻，靜置后于645nm波長處比色，測定其吸光度值A(chǔ)，通過GABA的標準曲線Y=0.1819X-0.0058（Y為GABA的濃度，mg/mL；X為A645，R2=0.998）求出GABA含量。

1.2.4 單因素實驗 考察脈沖強光單次能量、閃照次數(shù)、開始處理時間、物料厚度及閃照距離5個因素對糙米GABA的影響[9]。

1.2.4.1 單次能量對發(fā)芽糙米GABA含量的影響 糙米浸泡后，將單層糙米分別在單次能量為100、200、300、400、500J條件下閃照300次處理，閃照距離為11.3cm，以無脈沖強光處理為對照組，其他過程同“1.2.1”，以GABA含量為考察指標，下同。

1.2.4.2 閃照次數(shù)對發(fā)芽糙米GABA含量的影響 糙米浸泡后，將單層糙米在單次能量為400J條件下分別閃照100、200、300、400、500次處理，閃照距離為11.3cm，以無脈沖強光處理為對照組。

1.2.4.3 物料厚度對發(fā)芽糙米GABA含量的影響 將8、16、32g浸泡后的糙米（實驗中發(fā)現(xiàn)，剛好鋪滿培養(yǎng)皿所需糙米為8g左右）均勻鋪滿培養(yǎng)皿，視其料層厚度分別為1、2、4層，在單次能量為400J條件下閃照300次處理，閃照距離為11.3cm，以無脈沖強光處理為對照組，在處理過程中，適當翻動糙米，使其照射均勻。

1.2.4.4 閃照距離對發(fā)芽糙米GABA含量的影響 糙米浸泡后，將單層糙米在單次能量為400J條件下閃照300次處理，閃照距離分別為9.5、10.4、11.3、12.2、13.1、14.0cm，以無脈沖強光處理為對照組。

1.2.4.5 開始處理時間對發(fā)芽糙米GABA含量的影響 分別將浸泡前、浸泡后、發(fā)芽12h時的單層糙米在單次能量為400J條件下閃照300次處理，閃照距離為11.3cm，以無脈沖強光處理為對照組。

1.2.5 實驗條件優(yōu)化 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，由于物料厚度與GABA富集效果呈負相關(guān)，因此選取物料為8g，浸泡后進行脈沖強光處理效果明顯優(yōu)于其他處理方法，因此選取浸泡后進行脈沖強光處理。因此將單次能量（A）、閃照次數(shù)（B）、閃照距離（C）三個因素與發(fā)芽糙米中GABA含量進行響應(yīng)面實驗設(shè)計，優(yōu)化糙米發(fā)芽工藝。根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計原理[10]，通過Design Expert 8.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，預(yù)測糙米發(fā)芽的最佳工藝條件。各因素及水平編碼如表1所示。

表1 Box-Behnken實驗因素及水平Table 1 Three main induction conditions and their levels for Box-Behnken design

1.2.6 最佳發(fā)芽條件的驗證 根據(jù)優(yōu)化實驗結(jié)果，采用Design Expert軟件求得回歸方程，以發(fā)芽糙米GABA含量最大化為目標，計算得到培養(yǎng)發(fā)芽糙米工藝參數(shù)和理論含量，將得到的工藝參數(shù)修正以便于操作后，進行驗證實驗，評價工藝參數(shù)的可靠性。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用Design-Expert 8.0軟件進行Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計，進行數(shù)據(jù)的回歸和線性分析。數(shù)據(jù)經(jīng)過分析后，通過軟件會得到3D圖和等高線圖，用作進一步分析研究。根據(jù)統(tǒng)計確定系數(shù)R2判斷多項式模型方程的質(zhì)量。通過方差分析（ANOVA）來觀察顯著性，顯著性水平設(shè)置為p＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 單次能量對發(fā)芽糙米GABA含量的影響

圖1 單次能量對GABA含量的影響Fig.1 Effect of single energy on the GABA content

由圖1可以看出，脈沖強光處理對GABA含量的提高有一定促進作用。在一定范圍內(nèi)，單次能量越高，GABA含量越高；在400J處理時，GABA含量達到最大值。脈沖強光處理后，不同單次能量處理分別比對照組提高了15.5%、31.0%、45.1%、64.0%、15.5%。一定閃照次數(shù)下，單次能量太高，會讓對糙米內(nèi)部升溫很快，不利于酶活的提高；單次能量太低，酶活提高有限。本實驗條件下，單次能量400J較為適宜。

2.2 閃照次數(shù)對發(fā)芽糙米GABA含量的影響

圖2 閃照次數(shù)對GABA含量的影響Fig.2 Effect of flash number on the GABA content

由圖2可以看出，閃照次數(shù)不同，發(fā)芽糙米GABA含量不同；隨著閃照次數(shù)的升高，GABA含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；其中，閃照次數(shù)為300次時，種子內(nèi)部酶活被適當?shù)哪芰克ぐl(fā)使得GABA含量最高。少于或多于能量綜合都會降低GABA富集的含量。在單次能量固定的情況下，不同閃照次數(shù)的脈沖強光處理后，分別比對照組提高了9.4%、39.6%、64.0%、20.9%、2.8%。在實驗過程中，處理次數(shù)≥400次時，糙米表皮顏色明顯變深，影響糙米感官品質(zhì)，其他處理糙米表皮無明顯加深。本實驗條件下，閃照次數(shù)為300次較為適宜。

2.3 物料厚度對發(fā)芽糙米GABA含量的影響

圖3 物料厚度對GABA含量的影響Fig.3 Effect of material thickness on the GABA content

由圖3可以看出，物料厚度不同，脈沖強光閃照處理對糙米GABA含量影響不同。隨著物料厚度的增加，發(fā)芽糙米中GABA含量逐漸降低；料層厚度為4層時，脈沖強光閃照處理后，糙米中GABA含量僅提高了17.2%。本實驗條件下，由于脈沖強光的穿透力較差，只對糙米表層組織有影響，因此單層糙米進行脈沖強光處理效果最佳。

2.4 閃照距離對發(fā)芽糙米GABA含量的影響

由圖4可以看出，在其他處理條件相同，閃照距離不同的情況下，發(fā)芽糙米GABA含量有所不同，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；其中，閃照距離為11.3cm時，GABA含量最高。不同閃照距離的脈沖強光處理后，分別比對照組提高了43.5%、54.0%、64.0%、52.1%、 46.2%、33.9%。隨著閃照距離的加大，GABA含量先較快升高（可能是由于距離近脈沖強光能量過大造成種子內(nèi)部酶活性的降低，從而影響GABA富集含量的降低）達到最高值又緩慢下降（可能是脈沖強光隨著閃照距離的增大，部分能量散失所導(dǎo)致）的趨勢。本實驗條件下，閃照距離為11.3cm較為適宜。

2.5 開始處理時間對發(fā)芽糙米GABA含量的影響

圖4 閃照距離對GABA含量的影響Fig.4 Effect of flash distance on the GABA content

圖5 開始處理時間對GABA含量的影響Fig.5 Effect of start processing time on the GABA content

由圖5可以看出，不同時間進行脈沖強光處理，對糙米GABA含量影響不同。在浸泡前對糙米進行一定強度的脈沖強光照射處理，由于GAD的活性還沒有被激活因此對糙米中GABA含量影響很小。浸泡后脈沖強光處理，糙米GABA含量提高了64.0%。而發(fā)芽12h后脈沖強光處理，可能是浸泡過程中種子中的GAD被分解并散失到浸泡液中造成流失，使糙米發(fā)芽時的GABA含量僅提高了26.4%，但是此時對糙米進行閃照處理，糙米表面顏色易變深，甚至造成胚芽的損傷。本實驗條件下，脈沖強光開始處理時間選擇在浸泡后較為適宜。

2.6 響應(yīng)面分析法優(yōu)化脈沖強光處理條件結(jié)果分析

2.6.1 實驗因素水平編碼與實驗結(jié)果 應(yīng)用Design-Expert 8.0軟件進行Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計，分別在相應(yīng)的脈沖強光處理條件下進行糙米浸泡發(fā)芽培養(yǎng)，以發(fā)芽糙米中GABA含量為響應(yīng)值（Y），進行響應(yīng)面實驗，實驗設(shè)計及結(jié)果如表2所示[11]。

2.6.2 回歸模型的建立及統(tǒng)計分析 根據(jù)表2的實驗結(jié)果，通過Design Expert 8.0軟件處理確定回歸方程，該實驗的回歸方程為：

Y=347.6-14.33A-17.55B-4.78C-40.6AB-5.75AC-12.75BC-53.2A2-33.1B2-28.15C2

表2 Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Test design and results of Box-Behnken design

回歸模型進行方差分析及可信度分析結(jié)果見表3。

根據(jù)α=0.05顯著水平剔除不顯著項，簡化后的回歸方程為：Y=347.6-14.33A-17.55B-40.6AB-12.75BC-53.2A2-33.1B2-28.15C2

根據(jù)表3可知，該回歸模型顯著（p=0.0002），除了方程的一次項C和交互項AC影響不顯著，交互項BC影響顯著外，其他均極顯著，且該模型極顯著（p＜0.01）。因變量與自變量之間的線性關(guān)系顯著（R2= 0.9906），模型調(diào)整復(fù)相關(guān)系數(shù)R2adj=0.9735，說明該模型能解釋97.35%響應(yīng)值的變化，擬合程度較好[12]。失擬項不顯著（p＞0.05），說明本實驗所得二次回歸方程能很好地對響應(yīng)值進行預(yù)測[13]。

圖6 各兩因素交互作用對GABA含量影響的響應(yīng)曲面Fig.6 Response surface and contour plots showing the effects of pairwise interactions among various process conditions on the GABA content

表3 回歸方程的統(tǒng)計分析Table 3 Statistical analysis of regression equation

2.6.3 響應(yīng)面因素水平的優(yōu)化 回歸方程各交互項的響應(yīng)曲面見圖6。

根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面分析圖，運用Design Expert 8.0軟件對模型進行分析，尋求發(fā)芽糙米GABA含量最大值的穩(wěn)定點及對應(yīng)的因素水平[14]，由圖6可知，回歸模型存在穩(wěn)定點，穩(wěn)定點即極大值點，通過對 回 歸 模 型 求 一 階 偏 導(dǎo)[15]，得 到A、B、C的 編 碼 值 為-0.044、-0.234、-0.028，利用編碼公式Xi=（Xj-X0）/Δj將上述編碼值轉(zhuǎn)變?yōu)閷嶋H參數(shù)為：單次能量395.55J、閃照次數(shù)276.65次、閃照距離11.27cm，此時發(fā)芽糙米GABA含量為350.025mg/100g。

2.7 驗證實驗

將上述脈沖強光最佳參數(shù)修正為單次能量400J、閃照次數(shù)277次、閃照距離11.3cm，重復(fù)實驗5次，得發(fā)芽糙米GABA含量實測值為345.7mg/100g，與理論值350.025mg/100g接近，可以用此模型預(yù)測并指導(dǎo)生產(chǎn)實際。

3 結(jié)論

采用Box-Behnken響應(yīng)面法建立影響因素的二次回歸模型，對數(shù)據(jù)進行分析，糙米在30℃浸泡12h后，利用脈沖強光閃照處理富集GABA的最佳處理條件為單次能量400J、閃照次數(shù)277次、閃照距離11.3cm。擬合實驗誤差小，可為實際預(yù)測和評價發(fā)芽糙米GABA含量提供理論依據(jù)。

[1] 李思，方堅，梁建芬. 浸泡液對 糙米 發(fā)芽的影響 研究[J]. 食品科學(xué)，2007（7）：138-141.

[2] 姚森. 高γ-氨基丁酸含量的發(fā)芽糙米 品種篩選及 應(yīng)用[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[3]丁俊胄，劉貞，趙思明，等.糙米發(fā)芽過程中內(nèi)源酶活力及主要成分的變化[J]. 食品科學(xué)，2011（11）：29-32.

[4]Arazi T，Baum G，Snedden W A，et al.Molecular and biochemicalanalysis ofcalmodulin interaetions with the calmodulin-binding domain of plant glutamate decarboxylase[J]. Plant Physiol，1995，108（2）：551-561.

[5] 張璇，鮮瑤. 脈沖強光殺菌技術(shù)及其在果蔬上的應(yīng)用[J]. 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全，2011（3）：44-47.

[6]張暉，姚惠源，姜元榮.γ-氨基丁酸的功能性及其在稻米制品中的富集利用[J]. 糧食與飼料工業(yè)，2002（8）：41-43.

[7]管娜娜，張暉，王立，等.米糠中γ-氨基丁酸的富集及純化工藝研究[J]. 食品工業(yè)科技，2011（6）：292-295.

[8]孟祥勇.糙米、大豆發(fā)芽富集γ-氨基丁酸及復(fù)合谷物飲料的研究[D].無錫：江南大學(xué)，2009.

[9]蔣靜，馬濤.營養(yǎng)液培養(yǎng)糙米發(fā)芽富集GABA工藝條件優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)科技，2013（5）：195-199.

[10]姚森，鄭理，趙思明，等.發(fā)芽條件對發(fā)芽糙米中γ-氨基丁酸含量的影響[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2006（12）：211-215.

[11]張根生，丁琬瑩，王月，等.響應(yīng)面法優(yōu)化雙酶酶解酪蛋白工藝[J]. 食品科學(xué)，2013（21）：237-241.

[12]JOSHI S，YADAV S，DESAI AJ.Application of responsesurface methodology to evaluate the optimum medium components for the enhanced production of lichenysin by Bacillus licheniformis R2[J].Biochemical Engineering Journal，2008（2）：122-127.

[13]談佳玉，王承明.響應(yīng)面法優(yōu)化酶法制備花生蛋白的工藝研究[J]. 中國糧油學(xué)報，2011（8）：100-104.

[14]吳竹青，陳景，黃群，等.響應(yīng)面法優(yōu)化雪蓮果酒發(fā)酵工藝[J]. 食品科學(xué)，2010（23）：182-187.

[15]馬燕，高蕾，王青，等.響應(yīng)面法優(yōu)化浸提法提取甜杏仁油工藝參數(shù)[J]. 食品工業(yè)科技，2010（4）：229-231.

Optimization of pulsed light on the accumulation of GABA conditions in the process of brown rice germination

WANG Bo，MA Tao，HUI Li-juan，LIU He，HE Yu-tang
（College of Chemistry，Chemical Engineering and Food Safety，Bohai University，Grain and Oil Science and Technology Institute of Bohai University，Jinzhou 121013，China）

The enrichment of GABA during brown rice germination process was promoted by using pulsed light method.Meanwhile，the optimal treatment conditions were optimized by using response surface methodology：single energy of 400J，flash number of 277 and flash distance of 11.3cm.Under the optimized conditions ，the GABA content in germinated brown rice could reach to be 345.7mg/100g.

brown rice；GABA；pulsed light；response surface methodology（RSM）

TS201.1

B

1002-0306（2014）22-0281-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.053

2014－02－28

王勃（1986-），男，碩士研究生，實驗員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。