氯化鈣與加熱結(jié)合處理提取牛奶中cAMP的工藝研究

劉永峰，趙曉微，徐 陽，李蕊蕊（陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西西安 710062）

氯化鈣與加熱結(jié)合處理提取牛奶中cAMP的工藝研究

劉永峰，趙曉微，徐 陽，李蕊蕊（陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西西安 710062）

以牛奶為原料，離心去除牛奶中脂肪，采用不同濃度的氯化鈣在不同加熱條件下沉淀牛奶中蛋白質(zhì)，再通過冷卻結(jié)晶去除乳糖，分離提取牛奶中的環(huán)磷酸腺苷（cAMP），并采用高效液相色譜法定量測定所提取的cAMP含量，最后優(yōu)化確定cAMP的最佳提取工藝條件。結(jié)果表明，不同CaCl2濃度處理牛奶時，0.8mg/mL濃度處理組較2.0mg/mL濃度組差異不顯著（p＞0.05），但顯著高于1.2mg/mL和1.6mg/mL兩個濃度組（p＜0.05）；不同加熱溫度處理牛奶時，80℃處理組顯著高于其他三組（p＜0.05）；綜合兩個因素時，1.6mg/mL濃度的CaCl2在80℃加熱處理牛奶時cAMP含量為最高，達到（66.86±3.21）μg/mL。因此，牛奶中cAMP分離提取的最佳工藝條件為：加熱處理溫度80℃，CaCl2添加量1.6mg/mL。該工藝對于牛奶的綜合利用、增加牛奶附加值等方面具有重要意義。

牛奶，環(huán)腺苷酸，氯化鈣，加熱，高效液相色譜

牛奶中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)[1]，其中的乳蛋白含有大量的賴氨酸和蛋氨酸，能補充谷類蛋白質(zhì)的不足；乳脂肪以微粒狀的脂肪球分散在乳漿中，更容易消化吸收；乳糖有調(diào)節(jié)胃酸、促進胃腸道蠕動和消化液分泌的作用；含有人體所需要的各種維生素和礦物質(zhì)。除了這些主要的營養(yǎng)物質(zhì)外，牛奶中還含有微量的生物活性物質(zhì)如環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine-3’，5’-monophosphospate，cAMP）。cAMP溶于水，具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)，對酸、堿、熱都相當穩(wěn)定，在人與哺乳動物體內(nèi)，cAMP不僅參與機體多種酶的代謝過程，而且還可調(diào)節(jié)基因的表達，作為細胞的“第二信使”促進 mRNA的 轉(zhuǎn) 錄 ，影 響 蛋 白 質(zhì) 合 成[2-3]。 人 體 內(nèi) 缺 乏cAMP會導致惡性腫瘤、癌癥、失眠健忘、貧血、心血管疾病等眾多疾病的發(fā)生[4-5]；而且cAMP具有一定的藥用價值，能作為某些藥品（如環(huán)磷酸腺苷葡甲胺）的原料藥[6-7]。

目前，從天然動植物資源中提取cAMP的研究不多，主要集中于棗果cAMP的分離提取。動物資源的研究中，僅有本實驗室和馬志科等做了階段性工作[8-10]。本研究從牛奶中提取cAMP，對于牛奶的多元化綜合利用具有重要意義。但是，要從牛奶中分離提取cAMP，必須要去掉其中的多種大分子營養(yǎng)物質(zhì)，尤其是難以除去的蛋白質(zhì)。在食品科學領域，氯化鈣、熱處理均是沉淀蛋白質(zhì)的常用方法[11-12]，該方法在食品工業(yè)中安全性好，常被用于乳制品、黃酒等食品生產(chǎn)及水產(chǎn)品制品保藏[13-15]。綜上所述，本研究采用氯化鈣結(jié)合加熱法對牛奶中的cAMP進行分離提取，通過HPLC測定牛奶中cAMP含量，以期建立一種高效的牛奶中cAMP分離提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮牛乳 購于陜西省西安市郊農(nóng)戶家中，于4℃度條件下冷藏保存，至實驗使用；cAMP標準品 純度≥99%，色譜純，德國Sigma公司；甲醇 純度為99.8%，色譜純，加拿大Promptar公司；CaCl2、磺基水楊酸、磷酸二氫鉀 均為分析純。

高效液相色譜儀 美國Waters公司；色譜柱，HC-C18（5μm，4.6mm×250mm） 美 國Agilent公 司 ；TU-2000型紫外可見分光光度計 日本日立公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；D5-RZ型離心機型 湖南湘儀集團。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品去乳脂肪 將500mL鮮牛奶用紗布過濾，分裝至48個離心管，每管10mL，預熱至35~40℃，然后5000r/min，離心10min，讓乳脂上浮，除去乳脂肪[8]。

1.2.2 樣品去乳蛋白 將離心除去脂肪的牛奶分別加入0.8、1.2、1.6、2.0mg/mL的CaCl2，攪拌3min至混勻，每個處理濃度的樣品分別放置在烘箱的70、80、85、90℃條件下加熱，不同溫度保持若干時間，使乳蛋白變性沉淀，過濾乳得到初濾液。

為探究出不同溫度需要保持的時間，在過濾時取上清液1滴，放入黑色比色板孔中，加1滴20%磺基水楊酸[8]，如出現(xiàn)白色沉淀，證明還有蛋白質(zhì)存在，繼續(xù)加熱除去，直到無白色沉淀為止，過濾，取上清液于48個離心管中。

1.2.3 樣品去乳糖 將去脂肪、去蛋白后的濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，75℃濃縮，將提取液濃縮到占初濾液體積1/10～1/15時，冷卻濃縮液，邊攪拌邊冷卻至20℃，保持數(shù)小時，然后放入4℃的冰箱過夜，形成乳糖結(jié)晶于容器底部。取上清液于離心管中，離心5min，棄去沉淀得到液體cAMP。

1.2.4 HPLC法測定cAMP 取cAMP標準品溶液，稀釋1倍后，對其進行紫外全波長掃描，根據(jù)最大吸收率，確定檢測波長為259nm。采用保留時間法[16]，在相同的色譜條件下，以待測物質(zhì)的保留時間與標準品的保留時間相比對，相同的物質(zhì)應具有相同的保留時間，如果保留時間不同則肯定不是相同物質(zhì)，如此進行所要分析cAMP的定性。HPLC法測定牛奶中的cAMP色譜條件為[8-9]：色譜柱為C18，流動相為甲醇∶含0.05moL/L磷酸二氫鉀的雙蒸水（10∶90，V/V），流速為1mL/min；柱溫為25℃；進樣量為20μL。

1.2.5 樣品中cAMP含量的測定 研究設置4個氯化鈣濃度水平，每次固定一個濃度水平，測其在四個不同溫度條件下的CAMP值的平均值，研究設置4個加熱溫度水平，每次固定一個溫度水平，測其在四個濃度條件下的CAMP值的平均值。共16個處理，每個處理3個重復。每個樣品溶液過0.45μm濾膜，分別進樣進行HPLC測定。

根據(jù)下式，計算出每個處理樣品中cAMP的含量：cAMP含量（μg/mL）=cv/v1

式中：v為制備樣品溶液濃縮后的體積，mL；c為HPLC測定樣品溶液中cAMP濃度，μg/mL；v1為制備樣品溶液所用牛奶的體積，mL。

1.2.6 統(tǒng)計分析 每個樣品中cAMP含量在不同處理下分別計算，所有數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 軟件進行單因素多水平方差分析，并進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品中cAMP的色譜圖

cAMP標準品色譜圖和樣品cAMP色譜圖分別為圖1和圖2。圖1中cAMP標準品保留時間為3.389min，所有樣品中cAMP保留時間與cAMP標準品的保留時間一致，如圖2中樣品溶液cAMP保留時間為3.395min。并且樣品中的cAMP峰與其他峰的分離效果都較好。

圖1 cAMP標準品溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of cAMP standard solution

圖2 樣品溶液中cAMP的色譜圖Fig.2 Chromatogram of cAMP sample solution

2.2 樣品中cAMP含量的測定

牛奶樣品中cAMP含量的測定結(jié)果見圖3。四個濃 度 氯 化 鈣 處 理 組 之 間 比 較 ，0.8mg/mL 處 理 組（47.49μg/mL）較 1.2mg/mL 處 理 組（26.09μg/mL）和1.6mg/mL處理組（24.88μg/mL）的cAMP含量差異顯著（p＜0.05），較2.0mg/mL處理組（31.19μg/mL）差異不顯著（p＞0.05）；說明氯化鈣的濃度對于從牛奶中分離提取cAMP的影響明顯，可能通過影響蛋白質(zhì)的沉淀量，從而間接影響提取物中cAMP的含量。

四 個 加 熱 溫 度 組 之 間 比 較 ，80℃ 處 理 組（61.35μg/mL）較其他三組cAMP含量差異顯著（p＜0.05），其他三組之間差異不顯著（p＞0.05）；說明熱處理溫度對于牛奶中cAMP的分離提取也有非常明顯的影響，有可能通過影響蛋白質(zhì)沉淀以及破壞cAMP結(jié)構(gòu)兩個方面，從而影響了提取物中cAMP的含量。

不同氯化鈣濃度及不同加熱溫度組之間相比，總體差異較大。其中，0.8、1.6、1.2及2.0mg/mL的氯化鈣濃度在80℃加熱處理時，cAMP含量較高（p＜0.05），尤其以1.6mg/mL氯化鈣添加量在80℃加熱處理時為最高，達到（66.86±3.21）μg/mL。因此，牛奶中cAMP分離提取時，應選擇的最佳條件為：熱處理溫度為80℃，CaCl2濃度為1.6mg/mL。

圖3 牛奶樣品中cAMP含量測定結(jié)果圖Fig.3 Results of cAMP content in milk samples

3 討論

cAMP作為細胞的第二信使，來源廣泛，存在于所有動物、植物及微生物體內(nèi)。近年來，不少學者對cAMP的提取技術(shù)和測定方法進行了積極的探索和研究，發(fā)現(xiàn)獲取cAMP的方法一般有化學合成法、微生物發(fā)酵法和天然產(chǎn)物提取法[17]。目前，cAMP產(chǎn)品的制備主要采用化學合成法，并以核糖核酸為主要生產(chǎn)原料，制備工藝中使用的吡啶等化學物質(zhì)，對人體有毒害作用，其殘留物會對環(huán)境造成一定污染[18]。其次，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)cAMP存在培養(yǎng)周期長，產(chǎn)物不純，產(chǎn)物中可能含有微生物代謝產(chǎn)物等問題[19]，因此，利用動、植物組織為原料，從天然動植物中提取cAMP已成為cAMP提取的主要發(fā)展方向[20]。

利用植物組織為原料提取和檢測cAMP的研究較多圍繞棗開展。劉孟軍等首次在14中園藝作物中成功檢測出了cAMP[21]；張巖等用HPLC測定濃縮棗汁中 cAMP 含 量 為 4.56mmg/mL[22]，張 明 娟 等 用 HPLC 測定了8種棗果中cAMP的含量，含量最高為375.61μg/g，最低為46.01μg/g[23]；許牡丹等[24]在超聲波輔助下提取棗粉中的環(huán)磷酸腺苷，并以HPLC定量測定cAMP的提 取 率 為154.3μg/g，王 春 霞 等[25]利 用 納 膜 過 濾 后 濃縮、純化得到cAMP成品；王立霞等[26]研究發(fā)現(xiàn)不同品種干棗棗皮cAMP含量不同，含量較高的新疆和田玉棗干棗皮cAMP含量為888μg/g，經(jīng)工藝優(yōu)化，提取率可以達到250μg/g棗粉。以上研究中，雖然從植物原料中成功提取或檢測了cAMP，尤其是棗果內(nèi)的cAMP最為豐富，但是提取物中cAMP含量低于部分多酚單體，不占有含量優(yōu)勢，且后期的分離純化比較復雜。

利用動物性組織為原料提取和檢測cAMP研究較少。馬志科等[10]報道了從鮮羊奶中提取cAMP的方法，并利用放射免疫方法測定了cAMP含量，提取濃縮液濃度為6.58μg/mL。但是，羊奶中所提取的cAMP含量較低，沒有應用HPLC方法去檢測cAMP含量，所用放射免疫法存在危險性。另外，作者前期也采用三氯乙酸沉淀蛋白法輔助提取牛奶中cAMP，提取液中cAMP 含 量 為（29.02 ±1.58）μg/mL[8]，該 方 法 提 取 的cAMP含量雖然比羊奶中提取的高出3倍多，但是該含量遠遠低于本研究所提取的cAMP含量。

因此，在不斷分析研究天然動植物中cAMP的分離提取方法的基礎上，通過本次實驗建立了一套基于氯化鈣和加熱處理的牛奶中cAMP提取工藝。該工藝的建立，為從乳酪副產(chǎn)物、乳清、不合格牛奶中提取cAMP提供了理論基礎，從而將大大降低了cAMP生產(chǎn)成本，增加了產(chǎn)品的附加值。

4 結(jié)論

通過離心去除乳脂肪，采用不同濃度的CaCl2結(jié)合不同加熱處理去除乳中的蛋白質(zhì)，再通過低溫靜置沉淀除去乳糖，分離提取cAMP，并用HPLC法進行cAMP檢測。最終得出牛奶中cAMP的最佳分離提取工藝條件為：熱處理溫度80℃，CaCl2添加量為1.6mg/mL。該工藝提取的cAMP含量為（66.86± 3.21）μg/mL。

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Study on the extraction technology of cAMP combined calcium chloride and heating treatment in the milk

LIU Yong-feng，ZHAO Xiao-wei，XU Yang，LI Rui-rui
（College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China）

Milk as raw material was centrifuged to remove the lipids and then precipitated the proteins by appending with different concentration of calcium chloride （CaCl2） in different heating conditions.After being eliminated the lactose by cooling crystallization ，cyclic adenosine phosphate （cAMP ） extracted from milk was detected by high performance liquid chromatography （ HPLC ） .Finally ， the optimization condition of cAMP extraction technology was determined.As the results showed，comparing with the cAMP concentration dealed with different CaCl2concentrations there was no significant difference between the 0.8mg/mL CaCl2samples and 2.0mg/mL （p＞0.05 ） samples.However，the cAMP concentration of 0.8mg/mL CaCl2samples was higher than that of the 1.2mg/mL and 1.6mg/mL CaCl2samples （p ＜0.05 ）.While considering the heating effect on cAMP concentration ，the 80℃ group showed the higher production than the other three groups （p ＜0.05 ）.In combination with the two factors referred before，the optimal technique process was the 1.6mg/mL CaCl2with 80℃ ，so the cAMP concentration could reach as much as （66.86 ±3.21 ） μg/mL.Therefore ，we could get the optimum condition of the extraction and isolation of cAMP from milk：1.6mg/mL CaCl2，80℃ .This process was great significance for milk comprehensive utilization as well as increasing the added values of milk.

milk；cyclic nucleotide；calcium chloride；heating；HPLC

TS201.1

A

1002-0306（2014）22-0145-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.023

2014－03－03

劉永峰（1981-），男，博士，副教授，主要從事食品生物技術(shù)及營養(yǎng)學方面的研究。

陜西省科技計劃項目（2012NY2-17，2014KJXX-51）；大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（cx13065）。