安石榴苷的純化及對金黃色葡萄球菌抑菌作用的研究

徐云鳳，李光輝，封雨晴，呂曉英，吳 倩，夏效東

（西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌 712100）

安石榴苷的純化及對金黃色葡萄球菌抑菌作用的研究

徐云鳳，李光輝，封雨晴，呂曉英，吳 倩，夏效東*

（西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌 712100）

采用超聲波輔助法從石榴皮中提取單寧類物質(zhì)，并用Amberlite XAD-16大孔吸附樹脂進行柱層析，以甲醇梯度洗脫法進行純化，經(jīng)高效液相色譜對其組分進行分析后，以安石榴苷含量最高的組分對金黃色葡萄球菌進行抑菌實驗，分別測得抑菌圈直徑和最小抑菌濃度，并檢測了安石榴苷對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響。液相結(jié)果表明，隨著洗脫劑濃度的升高，安石榴苷的含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，最高含量達79.6%；抑菌結(jié)果表明，安石榴苷純化物對金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌效果，最小抑菌濃度為0.1mg/mL，安石榴苷純化物以劑量依賴的形式抑制金黃色葡萄球菌的生長。

石榴皮，安石榴苷，純化，高效液相色譜，抑菌作用

石榴（Punica granatum L．）是一種藥食兩用的植物資源，不僅營養(yǎng)豐富，而且具有多種醫(yī)療保健功效[1]。石榴皮為石榴加工產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)物，因其富含多酚類物質(zhì)，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域顯示出了極大的應(yīng)用價值[2-4]。在傳統(tǒng)中藥中，石榴皮被廣泛用于治療多種感染類疾病，如痢疾、腹瀉、寄生蟲感染以及呼吸系統(tǒng)感染等[5]。目前的體外研究表明，石榴皮中的鞣質(zhì)因其能凝固微生物體內(nèi)的原生質(zhì)及對多種酶的影響，對多種細菌、真菌有抑制作用[6]。安石榴苷是石榴皮 鞣 質(zhì) 類成 分 的 主 體 ，約 占 石 榴 皮 的 10%[7]，其 含 量遠遠高于鞣花酸等其他鞣質(zhì)成分，并且同鞣花酸相比，安石榴苷具有較好的水溶性，因而近年來引起了人們廣泛的注意。Eliana等[8]研究表明，石榴皮抑制兩種念珠菌屬的活性成分為安石榴苷。Ira Glazer等[9]則報道了石榴皮水提物可以顯著抑制腐敗真菌的生長，其抗菌活性與石榴總多酚的含量相關(guān)，安石榴苷為其主要的抗菌鞣質(zhì)類活性成分。

植物多酚的分離純化方法包括層析法、有機溶劑萃取法、膜分離法、沉淀分離法等，以大孔吸附樹脂為填料的柱層析法是常用的方法之一[10]。大孔樹脂具有選擇性強、吸附容量大、吸附速度快、解吸容易、成本低等優(yōu)點，在天然產(chǎn)物分離純化中呈良好的發(fā)展趨勢[11]。因此，本研究采用大孔吸附樹脂純化的方法對石榴皮丙酮提取物進行純化，并采用高效液相色譜法進行檢測，以期得到較高純度的安石榴苷，隨后研究了安石榴苷純化物對金黃色葡萄球菌的體外抑菌作用，為石榴皮功能成分的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴 產(chǎn)自陜西省西安市臨潼區(qū)的嶧城，洗凈，手工取皮，將皮置于50℃下烘干，粉碎后過60目篩，粉末置于棕色瓶中，于4℃冰箱中保存；供試菌株 金黃色葡萄球菌ATCC 25923；安石榴苷（純度98%，CAS編號65995-63-3） 成都曼思特生物科技有限公司；磷酸（優(yōu)級純） 天津市科密歐化學試劑有限公司；乙腈（色譜純） 美國TEDIA公司；Amberlite XAD-16大孔吸附樹脂 美國SIGMA公司；LB瓊脂、LB肉湯 北京陸橋技術(shù)有限責任公司；其他試劑 分析純。

高速萬能粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司；DGG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；LGJ型冷凍干燥機 北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；AL204型電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；Waters 600E高效液相色譜儀 美國WATERS公司；牛津杯（外直徑8mm、內(nèi)直徑6mm、高度10mm） 北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司；細菌培養(yǎng)箱 上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；紫外分光光度計、酶標儀 美國BIO-RAD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 石榴皮單寧的提取 用60%的丙酮作為提取溶劑，在40℃下，采用超聲波輔助法進行提取，超聲時間為10min，超聲功率80W，料液比為1∶10。提取完畢，用真空泵抽濾，使濾液與濾渣分離，將濾渣在相同條件下進行二次提取，合并提取液，將提取液于50℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無丙酮味，得到濃縮液。

1.2.2 安石榴苷的純化 大孔吸附樹脂的預(yù)處理參照朱靜等[12]的方法。純化方法為采用濕法裝柱（柱長徑比為6∶1），上樣量為200mL濃縮液/500g樹脂，然后用大量水洗脫去糖（約4L），直到流出液澄清為止，接下來用不同濃度的甲醇進行梯度洗脫，甲醇濃度依次為15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、100%，每個濃度各800mL，最后又用另外800mL純甲醇將柱子徹底洗脫干凈，分別收集洗脫液，于50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，再進行真空冷凍干燥，得到淺棕色粉末狀的純化物[13]。

1.2.3 液相色譜分析

1.2.3.1 標準樣品及待測樣品溶液的配制 分別準確稱取安石榴苷標準品及待測樣品0.005g，用水溶解，并用容量瓶定容至10mL，配制成0.5mg/mL的儲備液，-20℃保存。上樣前用0.45μm濾膜過濾。

1.2.3.2 色譜條件和洗脫程序 色譜柱為Waters C18柱（250mm×4.6mm，5μm），柱溫30℃，紫外檢測器，波長378nm，流動相為0.1%的磷酸水溶液（A液）和0.1%的磷酸乙腈溶液（B液），線性梯度洗脫，流速為1.0mL/min，進樣量10μL。梯度洗脫程序：0~10min 5% ~40%B，10~20min 40%~55%B，20~25min 55%~ 60%B，25~30min 60%~90%B，30~35min 90%~5% B，35~45min 5%B。

1.2.4 抑菌效果研究

1.2.4.1 菌懸液的制備 將細菌從-80℃冰箱取出后，劃線接種于LB瓊脂培養(yǎng)基上，使之活化，再用無菌棉簽將細菌抹下，涮至無菌生理鹽水中，將菌懸液吸光度調(diào)至OD600等于0.5，稀釋100倍（約含菌106CFU/mL），備用。

1.2.4.2 抑菌活性測定 抑菌活性采用牛津杯法測定[14]。取100μL上述菌懸液，涂布于LB瓊脂平板上，用無菌鑷子取經(jīng)高壓蒸汽滅菌的牛津杯，平置于已涂布菌液的培養(yǎng)皿表面，輕輕按壓，每個培養(yǎng)皿放置3只牛津杯，分別注入200μL質(zhì)量濃度分別為4、2、1mg/mL的安石榴苷純化物溶液，每個濃度做3個平行實驗，置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h后，測量抑菌圈直徑大小。

1.2.4.3 最小抑菌濃度實驗 采用瓊脂稀釋法，向滅菌后冷卻至50℃的LB培養(yǎng)基中加入安石榴苷純化物，使其終濃度分別為4、2、1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125mg/mL，各倒入兩個培養(yǎng)皿中做平行實驗。待冷卻凝固后，分別在瓊脂表面滴加2μL上述菌懸液，每個平板上滴加三滴，待干燥后將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24h，觀察細菌生長情況。以不加安石榴苷純化物的平板為陽性對照，確定無菌生長的最低稀釋濃度為最小抑菌濃度。

1.2.4.4 生長曲線的測定 將安石榴苷純化物溶于無菌的LB肉湯中，配成0.2mg/mL的溶液，采用對半稀釋法稀釋得到0.1、0.05、0.025mg/mL的溶液。將細菌接種于LB肉湯中，培養(yǎng)至OD600約等于0.2，實驗組往96孔板中分別加入100μL不同濃度的純化物溶液和100μL菌懸液，對照組加入100μL不同濃度的純化物溶液和100μL無菌LB肉湯，分別做三個平行，每隔一小時用酶標儀測定600nm下的吸光度，實驗結(jié)果以實驗組吸光度減去對照組吸光度表示。

表1 不同組分的純化物中安石榴苷的含量Table 1 The content of punicalagin from different compotents

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜檢測安石榴苷的含量

圖1說明，在1.2.3所指定的色譜條件下，樣品基本達到了基線分離，效果良好。其中，α和β為安石榴苷的兩個同分異構(gòu)體。

根據(jù)保留時間進行定性，根據(jù)不同組分的峰面積與標準品（已知濃度）的峰面積的比值進行定量，結(jié)果如表1所示。可以看出，安石榴苷α、β同分異構(gòu)體的質(zhì)量分數(shù)合計最高可達79.6%；最高純度的安石榴苷（組分6）是采用40%的甲醇洗脫下來的；隨著洗脫劑濃度的升高，安石榴苷的含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。

2.2 抑菌效果

2.2.1 抑菌圈直徑 據(jù)圖2所示，安石榴苷純化物（組分6）對金黃色葡萄球菌可以產(chǎn)生明顯的抑菌圈，表明安石榴苷具有良好的抑菌效果。從表2可以看出，抑菌圈直徑大小與純化物濃度成正相關(guān)，4mg/mL濃度下的抑菌圈直徑達20.2mm。

圖1 安石榴苷標準品（a）及石榴皮純化物（b~k）的液相色譜圖Fig.1 Chromatograms of punicalagin（a）and purified pomegranate peel extracts（b~k）

圖2 不同濃度純化物下的抑菌圈直徑Fig.2 Inhibition zone diameter by different concentrations of purified extracts

表2 抑菌圈直徑大小Table 2 The size of inhibition zone diameter

2.2.2 最小抑菌濃度 通過瓊脂稀釋法，測得安石榴苷純化物濃度在0.1mg/mL時，無細菌生長，即最小抑菌濃度為0.1mg/mL。

2.2.3 生長曲線 純化物對細菌生長的影響如圖3所示。從圖3中可以看出，對照組的金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)接后迅速進入對數(shù)生長期，5~12h達到穩(wěn)定期，而加入安石榴苷純化物后，金黃色葡萄球菌的生長受到抑制，菌體數(shù)目雖有增加，但并沒有達到正常的生長高峰，之后趨于穩(wěn)定。安石榴苷以劑量依賴的的形式抑制金黃色葡萄球菌的生長，0.1mg/mL下抑制作用明顯，0.0125mg/mL下幾乎沒有影響。

圖3 不同濃度的純化物對細菌生長曲線的影響Fig.3 Growth curves with different concentrations of purified extracts

3 討論

3.1 Amberlite XAD-16是一種非離子型多聚吸附樹脂，可用于吸附極性溶劑中的疏水分子，國內(nèi)外均有采用Amberlite XAD-16純化石榴皮多酚的報道[12-13，15]，本研究選擇了XAD-16大孔吸附樹脂對安石榴苷進行純化，以甲醇為洗脫劑，采用梯度洗脫的方法，取得了良好的純化效果。

3.2 安石榴苷純化物對金黃色葡萄球菌具有良好的抑菌效果。Al-Zoreky等[16]曾報道石榴皮甲醇提取物對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為2mg/mL；Braga等[17]則報道了1%（v/v）的石榴皮提取物可完全抑制金黃色葡萄球菌在肉湯的生長。然而，由于提取物中酚類物質(zhì)含量不同，所用受試菌株有差異以及采用的抑菌方法有區(qū)別等，導致不同研究者之間的實驗結(jié)果很難進行直接對比。

表3 純化物的抑菌效果Table 3 Antibacterial effects of purified extract

4 結(jié)論

采用Amberlite XAD-16大孔吸附樹脂進行梯度洗脫純化，可以獲得較高純度的安石榴苷，最高含量達79.6%；安石榴苷純化物對金黃色葡萄球菌具有良好的抑菌效果，最小抑菌濃度為0.1mg/mL，并且安石榴苷純化物以劑量依賴的形式抑制金黃色葡萄球菌的生長。本研究為安石榴苷應(yīng)用于天然藥抑菌劑、食品防腐劑等提供理論和實驗基礎(chǔ)。隨著石榴中活性成分研究的不斷深入，石榴的開發(fā)利用前景將會越來越廣闊。

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Purification of punicalagin and its antibacterial activity against Staphylococcus aureus

XU Yun-feng，LI Guang-hui，F(xiàn)ENG Yu-qing，LV Xiao-ying，WU Qian，XIA Xiao-dong*
（College of Food Science and Engineering，Northwest A&F University，Yangling 712100，China）

Pomegranate peel tannins were extracted by ultrasonic-assisted extraction and purified by Amberlite XAD-16 macroporous resin.Gradient methanol was used as elution solution.Then the components were determined by high performance liquid chromatography（HPLC） analysis.The eluate with the highest content of punicalagin was used for the antimicrobial asssays.Inhibition zone diameters and the minimal inhibitory concentration （MIC） were investigated.The effect of punicalagin on the growth of Staphylococcus aureus was also monitored.HPLC showed that the purity of the eluate increased at first then decreased with the increasing concentration of ethanol.The highest purity among the different eluates was 79.6%.Antimicrobial study demonstrated that punicalagin exhibited good inhibitory effects against Staphylococcus aureus，the MIC was determined as 0.1mg/mL.Punicalagin inhibited the growth of Staphylococcus aureus in a dose-dependent manner.

pomegranate peel；punicalagin；purification；HPLC；antimicrobial activity

TS201.3

A

1002-0306（2014）22-0110-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.016

2014－02－17

徐云鳳（1989-），女，博士，主要從事天然植物提取物抑菌方面的研究。

* 通訊作者：夏效東（1981-），男，教授，主要從事食品安全及營養(yǎng)方面的教學與研究。

國家自然科學基金（項目批準號31101347）。