食品過敏原大豆成分LAMP實時濁度檢測法的建立

鄺筱珊，成曉維，游淑珠，王小玉，劉李登，馮家望

（珠海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東珠海 519015）

食品過敏原大豆成分LAMP實時濁度檢測法的建立

鄺筱珊，成曉維，游淑珠，王小玉，劉李登，馮家望*

（珠海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東珠海 519015）

根據(jù)過敏原大豆的保守內(nèi)源基因Lectin的序列，設(shè)計6條特異性LAMP引物，利用實時濁度儀對反應(yīng)體系中擴增產(chǎn)物的實時監(jiān)控篩選出最佳引物，建立食品中過敏原大豆成分的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）檢測方法，并對該方法的特異性、靈敏度、穩(wěn)定性進行了評價。結(jié)果表明：該方法能夠特異性檢出食品中的過敏原大豆成分，特異性高，靈敏度達0.1%（w/w）。對含有大豆成分為10%、1%、0.1%、0%（w/w）的樣品分別進行20次重復(fù)實驗，其穩(wěn)定性好，假陽性和假陰性率為0%。本實驗建立的LAMP方法適用于特異性快速檢測食品中的過敏原大豆成分。

環(huán)節(jié)導(dǎo)等溫擴增法（LAMP），實時濁度儀，過敏原，大豆，檢測

食物過敏是人的機體對外源物質(zhì)（過敏原）產(chǎn)生的一種常見變態(tài)反應(yīng)。在過去的20年里，食物過敏的發(fā)病率顯著上升，過敏原己成為食品安全隱患之一[1]。各國政府和國際組織非常重視這個問題，先后通過嚴密的科學(xué)調(diào)查和理發(fā)論證，相繼修改和出臺規(guī)范食品中過敏物質(zhì)標識的法律方案，對食品標簽上過敏原成分的標注作出嚴格規(guī)定，尤其是歐美、日本等發(fā)達國家[2]。我國的國家標準GB7718-2011《預(yù)包裝食品標簽通則》也推薦標識大豆等常見致敏物質(zhì)。大豆作為含有豐富蛋白質(zhì)的豆科植物，由于其豐富的營養(yǎng)特性和功能屬性被廣泛應(yīng)用于配方食物、肉類和家禽類產(chǎn)品、面包點心、乳制品和各種可食用產(chǎn)品中。據(jù)報道，有90%的食物過敏情況都是由八大類食品造成的，而大豆就是其中之一[3]。大豆過敏患者在攝食大豆及其制品或者吸入大豆粉末時可能出現(xiàn)惡心、嘔吐、舌咽腫、嘴唇紅腫、口腔疼痛和一些腸道疾病等臨床癥狀，嚴重的會導(dǎo)致休克甚至死亡[4]。關(guān)于食用大豆后過敏致死的事件已有報道[5]。

目前，對食物過敏最有效最直接的治療手段是避免食用含有過敏原的食物，因此大豆過敏原檢測技術(shù)對大豆過敏患者的安全消費意義重大。食物過敏原檢測方法既可以基于蛋白，也可以基于DNA[6-8]。前者包括電泳法[9]、色譜法、質(zhì)譜法和免疫學(xué)方法，如酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）[10]、放射過敏原吸收抑制實驗[11]、免疫印跡[12]和免疫擴散及各種試劑盒等；后者主要采用各種PCR方法，如實時熒光定量PCR、多重PCR等[13-15]。也有新型技術(shù)如生物傳感器[16]、生物芯片技術(shù)[17]等方法。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（loop mediated isothermal amplification，LAMP）是Notami等開發(fā)的一種簡單快速、特異性強的體外恒溫擴增方法[18]。該方法針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4條特異的引物，利用鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件保溫條件下完成核酸擴增反應(yīng)，通過觀察副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀的濁度或者顯色反應(yīng)即可判定結(jié)果。無需昂貴的儀器設(shè)備，具有耗時、操作簡單的優(yōu)勢，更適合基層的推廣應(yīng)用。本研究采用LAMP實時濁度法對食品中過敏原大豆成分進行檢測，為食品的風(fēng)險評估、加工、管理及過敏原成分的標識提供可靠的技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆、四季豆、羽扇豆、鷹嘴豆、荷蘭豆、豌豆、扁豆、豇豆、蠶豆、紅豆、綠豆、燕麥、蕎麥、黑麥、小麥、大麥、花生、芝麻、雞肉、魚肉、牛肉、鵝肉、鴨肉、羊肉、豬肉、蝦肉、蟹肉、扇貝、胡蘿卜、芹菜、核桃 購于珠海超市或?qū)嶒炇易粤魳?；食品樣?購于珠海超 市 ；DNA 提 取 試 劑 盒 Biosprint 15 DNA plant kit QIAGEN公司；Bst DNA polymerase large fragment New England Biolabs公 司 ；甜 菜 堿（Betaine） 10 × Thermol Buffer，Sigma公司；dNTPs 寶生物工程（大連）有限公司；LAMP引物 寶生物工程（大連）有限公司。

LA-320C型LAMP實時濁度儀 日本榮研化學(xué)株式會社；NanoDrop型紫外分光光度計 美國Thermo公司；PCR儀7500Fast型實時熒光定量 美國ABI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 LAMP引物設(shè)計 60～65℃是雙鏈DNA復(fù)性及延伸的中間溫度，DNA在65℃左右處于動態(tài)平衡狀態(tài)，任何一條引物與雙鏈DNA的互補部位進行堿基互補配對延伸的時候，另一條鏈就會脫落變成單鏈。LAMP方法正是利用這一特點進行反應(yīng)的。利用4條特異性引物依靠一種高活性鏈置換DNA聚合酶，使得鏈置換DNA的合成在不停的自我循環(huán)[19]。LAMP反應(yīng)階段，隨著反應(yīng)的進行，dNTP會釋放出焦磷酸根離子，焦磷酸根離子遇到Mg2+會生成焦磷酸鎂白色沉淀，而實時濁度儀每6s自動對每個反應(yīng)管的濁度進行測定，可實時監(jiān)控擴增反應(yīng)中沉淀物的增加。根據(jù)LAMP引物設(shè)計的原則，在NCBI網(wǎng)站中查找Lectin基因相關(guān)序列，利用DNAMAN軟件對查到的各序列進行比對，使用在線設(shè)計軟件Primer Explorer version4和LAMP Designer軟件設(shè)計特異引物，設(shè)計多套LAMP引物。利用實時濁度儀對反應(yīng)體系中擴增產(chǎn)物的實時監(jiān)控篩選出最佳引物。共6條分別為內(nèi)引物FIP包含F(xiàn)1c（與Fl區(qū)域互補）和F2序列，內(nèi)引物BIP包含B1c（與B1區(qū)域互補）和B2序列，外引物為F3和B3序列，本研究在內(nèi)外引物的基礎(chǔ)上引入環(huán)引物FLP和BLP。引入環(huán)引物后，當(dāng)?shù)谝浑A段的啞鈴狀莖環(huán)結(jié)構(gòu)形成，環(huán)引物能與其結(jié)合并引導(dǎo)擴增。即引入環(huán)引物后，自主擴增增加了兩個位點，加快擴增進程，大大縮短了反應(yīng)時間。引物序列見表1。

1.2.2 樣品DNA提取 將待測樣品用潔凈研缽或粉碎裝置充分研磨混勻，食品樣品的取樣部位盡可能覆蓋其各種原料成分。稱取1g樣品進行DNA提取，DNA提取步驟按試劑盒的說明書進行，所提取的DNA經(jīng)紫外分光光度計檢測濃度并稀釋至100ng/μL，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 LAMP擴增反應(yīng) 反應(yīng)總體積為25μL，包括10× Thermol Buffer 2.5μL、內(nèi)引物FIP和BIP（40μmol/L）各1.0μL、外引物F3和B3（10mol/L）各0.5μL、FLP和BLP（20μmol/L）各 1.0μL、dNTPs（10mmol/L）4.0μL、甜 菜堿（5mol/L）5.0μL、硫 酸 鎂（150mmol/L）1.0μL、Bst DNA聚合酶（8U/μL）1.0μL、模板DNA（約100ng/μL ）2.0μL，用滅菌去離子水補齊到25.0μL，充分混勻。實時濁度儀63℃恒溫反應(yīng)1h，最后80℃滅活5min結(jié)束反應(yīng)。

1.2.4 特異性實驗 利用建立的LAMP實時濁度法，分別以大豆、四季豆、羽扇豆、鷹嘴豆、荷蘭豆、豌豆、扁豆、豇豆、蠶豆、紅豆、綠豆、燕麥、蕎麥、黑麥、小麥、大麥、花生、芝麻、雞肉、魚肉、牛肉、鵝肉、鴨肉、羊肉、豬肉、蝦肉、蟹肉、扇貝、胡蘿卜、芹菜、核桃的DNA作為LAMP反應(yīng)模板，以ddH2O為空白對照，進行LAMP反應(yīng)，以評價該方法的特異性。

1.2.5 靈敏度實驗 用研磨機將大豆和小麥磨成粉末狀，并60℃烘干6h。用小麥粉配成大豆粉含量為10%、5%、1%、0.5% 、0.1% 、0.05% 和0.01%（W/W）的混合樣品，以小麥粉為陰性對照，用于過敏原大豆成分的重量比靈敏度測試。

1.2.6 穩(wěn)定性實驗 利用建立的LAMP實時濁度法，對大豆含量為10%、1%、0.1%、0%（w/w）4個不同濃度的樣品分別進行20次重復(fù)擴增，以評價該方法的穩(wěn)定性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用實時濁度儀的LA-320CE軟件分析擴增反應(yīng)，橫坐標為擴增時間，縱坐標為濁度值，產(chǎn)生濁度曲線表明發(fā)生擴增反應(yīng)，并篩選濁度出峰時間早，峰值較高的引物為反應(yīng)引物。

表1 LAMP引物序列Table 1 LAMP primers sequence

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP引物篩選結(jié)果

用大豆DNA作為陽性模板進行引物的初步篩選，在所設(shè)計的多套引物中，選擇發(fā)生了擴增反應(yīng)，且出峰時間較早，峰高值較高的一套引物。該套引物出峰時間為45min左右，峰高為0.16（見圖1）。對該套引物引入環(huán)引物進行優(yōu)化，引入環(huán)引物后，出峰時間提前至22min左右（見圖2）。

圖2 引入環(huán)引物的LAMP引物實驗結(jié)果Fig.2 Result of LAMP primers with ring

2.2 特異性實驗結(jié)果

利用建立的LAMP實時濁度法，對31種成分進行檢測。結(jié)果顯示，除大豆出現(xiàn)了陽性擴增外，其余30種成分均未發(fā)生擴增。實驗表明該LAMP引物具有特異性（見圖3）。

2.3 靈敏度實驗結(jié)果

利用建立的LAMP實時濁度法，對大豆含量為10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%（w/w）的樣品進行檢測，含量為10%、5%、1%、0.5%、0.1%的樣品均發(fā)生了擴增反應(yīng)，含量為0.05%、0.01%及陰性對照小麥粉樣品未發(fā)生擴增反應(yīng)（見圖4），實驗表明，該方法檢測大豆過敏原成分的靈敏度為0.1%（w/w）。

2.4 穩(wěn)定性實驗結(jié)果

利用建立的LAMP實時濁度法，對大豆含量為10%、1%、0.1%、0%（w/w）的4個樣品分別進行20次重復(fù)實驗，假陽性率和假陰性率為0%，表明本實驗建立的LAMP實時濁度法對過敏原大豆成分的檢測具有良好的穩(wěn)定性。

圖3 LAMP實時濁度法特異性實驗結(jié)果Fig.3 Results of specificity test by real-time turbidimeterbased LAMP

2.5 實際樣品檢測

從超市收集大豆加工產(chǎn)品38份以及不含大豆成分的樣品22份。用本實驗建立的LAMP實時濁度法對這60個樣品進行檢測，并與熒光PCR法的結(jié)果進行比較，評價該方法的實際應(yīng)用價值，實驗結(jié)果見表3。實時熒光PCR法根據(jù)SN/T 1961.19-2013進行。

圖4 LAMP實時濁度法靈敏度實驗結(jié)果Fig.4 Results of sensitivity test by real-time turbidimeterbased LAMP

表2 實際樣品檢測Table 2 Test results of commercial samples

表3 實際樣品檢測Table 3 Test results of commercial samples

在實際樣品檢測中，熒光PCR法的Ct值及LAMP實時濁度法的峰值拐點時間與樣品中過敏原大豆成分的含量成正比關(guān)系。上述樣品的檢測中，熒光PCR法的Ct值出現(xiàn)在50~70min，而LAMP實時濁度法的峰值拐點則出現(xiàn)在18~30min，LAMP實時濁度法的檢測時間明顯比熒光PCR法的檢測時間短。并且在實際應(yīng)用中，LAMP法僅需在簡單的恒溫設(shè)備中進行，以肉眼觀察反應(yīng)管中產(chǎn)生的白色沉淀判斷結(jié)果，操作簡便，成本低，更適合基層實驗室甚至現(xiàn)場實驗。

3 結(jié)論

本研究建立了食品中過敏原大豆成分的LAMP實時濁度檢測方法，引入環(huán)引物的LAMP引物使擴增反應(yīng)從1h內(nèi)進一步縮短至30min內(nèi)。該方法的靈敏度為0.1%（w/w）。對4個不同質(zhì)量濃度的大豆樣品分別進行20次重復(fù)實驗，假陽性率及假陰性率為0%。對31種成分的測試中僅有大豆成分出現(xiàn)陽性擴增，其他成分均無出現(xiàn)擴增。對60個實際樣品的檢測結(jié)果與熒光PCR法的結(jié)果一致，并與預(yù)期相符，表明該方法具有良好的穩(wěn)定性和特異性，適用于食品中過敏原大豆成分的快速檢測。

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Development of a real-time turbidimeter-based LAMP method for detection of allergen soybean in food

KUANG Xiao-shan，CHENG Xiao-wei，YOU Shu-zhu，WANG Xiao-yu，LIU Li-deng，F(xiàn)ENG Jia-wang*
（The Inspection Technical Center of Zhuhai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhuhai 519015，China）

According to the endogenous gene of allergen soybean Lectin ， six specific LAMP primers were designed.A loop-mediated isothermal amplification（LAMP） method for detecting allergen soybean in food was established.Real-time monitoring of the LAMP reaction was achieved by a turbidimeter.Specificity ，sensitivity，stability and repeatability of this method were tested.The results showed that the method could specifically detect the soybean in food，and the detection sensitivity of the method was 0.1% （w/w）.With the soybean sample of 10%，1%，0.1%，0%（w/w） concentration as templates，stability and repeatability testing was conducted，false negative rate was 0%.The results showed that the LAMP method is suitable for specifically detecting allergen soybean in food.

loop-mediated isothermal amplification（LAMP）；real-time turbidimeter；allergen；soybean；detection

Q78

A

1002-0306（2014）22-0065-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.005

2014－02－10

鄺筱珊（1982-），女，碩士研究生，工程師，研究方向：食品安全檢測。

* 通訊作者：馮家望（1965-），男，碩士研究生，研究員，研究方向：食品安全檢測。

國家質(zhì)檢總局科技計劃項目（2011IK255）。