元胡止痛系列制劑指紋圖譜研究

鄭露露，董遠文，黃 蕾，楊 希，聶 晶

（1.湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，湖北武漢430064；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北武漢430065）

元胡止痛系列制劑指紋圖譜研究

鄭露露1，2，董遠文2，黃 蕾2，楊 希2，聶 晶1

（1.湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，湖北武漢430064；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北武漢430065）

目的建立元胡止痛系列制劑統(tǒng)一的指紋圖譜。方法采用Thermo Acclsim 120 C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱，乙腈－甲醇（4∶1）為流動相A，25 mmol·L－1乙酸鈉溶液（含庚烷磺酸鈉15 mmol·L－1，用冰醋酸調(diào)pH＝6.4）為流動相B，檢測波長：280 nm；柱溫：35℃，流速：1 mL·min－1進行梯度洗脫。結(jié)果指紋圖譜共標(biāo)定9個共有峰，利用對照品比對歸屬了5個峰，另采用Waters xevo G2 Q－Tof LC／MS對另外4個色譜峰進行了指認。結(jié)論 該方法分析時間短、耐用性好，可用于元胡止痛系列制劑的質(zhì)量控制。

元胡止痛；指紋圖譜；UPLC／DAD／Q－TOF－MS

元胡止痛系列制劑的處方由延胡索和白芷兩味藥組成，具有理氣、活血、止痛的功效。目前具有藥品批準文號的元胡止痛口服固體制劑有元胡止痛片、膠囊、軟膠囊、滴丸和顆粒，其中元胡止痛片、膠囊、軟膠囊被《中國藥典》2010年版收載［1］。延胡索的主要成分為生物堿類化合物，白芷的主要成分為香豆素類化合物［2，3］。當(dāng)前對元胡止痛系列制劑的指紋圖譜研究主要集中于單個劑型［4］，本實驗室在前期工作中建立了元胡止痛系列制劑指紋圖譜［5］，但其主要目的是闡述元胡制劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，該方法分析時間長，在不同的色譜柱上相對保留值不穩(wěn)定。本實驗在前期工作的基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化了分析方法，比較分析了不同HPLC指紋圖譜評價方法，各評價方法的結(jié)果均表明該指紋圖譜分析方法穩(wěn)定、適用性強，并總結(jié)了各評價方法的優(yōu)缺點，為HPLC指紋圖譜標(biāo)準的制定提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Dionex U3000高效液相色譜儀；Waters e2695型高效液相色譜儀；Shimadzu LC－20AD高效液相色譜儀；Waters xevo G2 Q－Tof液質(zhì)聯(lián)用儀；Waters 2489UV／Visible Detector；色譜柱：①Thermo Acclsim 120 C18；②Dionex Acclaim 120 C18；③Waters Symmetry C18。甲醇、乙腈為色譜純；水為重蒸水；其余試劑均為分析純。

1.2 試藥 對照品鹽酸巴馬?。ㄅ枺?10732－200005）、延胡索乙素（批號：110726－200610）、歐前胡素（批號：110826－201013），對照藥材延胡索（批號：120928－201007）、白芷（批號：120945－200707）均購于中國藥品生物制品檢定所；對照品海罌粟堿（批號：00007241－807）購于ChromaDe；對照品去氫延胡索甲素（批號：042－30751）購于和光純藥工業(yè)株式會社。

元胡止痛片劑、膠囊劑均為多家生產(chǎn)，片劑共收集了3家企業(yè)的3批樣品，膠囊劑共收集了3家企業(yè)的3批樣品；元胡止痛滴丸／顆粒／軟膠囊均為獨家生產(chǎn)品種，共收集了滴丸／顆粒／軟膠囊各3批樣品。各劑型的樣品收集情況見表1。

表1 各劑型樣品收集情況一覽表

2 方法

2.1 色譜條件 采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱，乙腈－甲醇（4∶1）為流動相A，25 mmol·L－1乙酸鈉溶液（含庚烷磺酸鈉15 mmol·L－1，用冰醋酸調(diào)pH＝6.4）為流動相B，檢測波長：280 nm；柱溫：35℃，流速：1 mL·min－1，梯度洗脫程序為：0～50 min，35%～60%A；50～55 min，60%～35%A，55～60 min，35%A。

2.2 質(zhì)譜條件 離子化模式為ESI＋：碰撞能低能量為4 V，梯度高能量為15～60 V，碰撞氣體為高純氬氣；毛細管電壓為（3 000 V／2 600 V），錐孔電壓為（10 V／12 V），除溶劑溫度為350℃，除溶劑氣體為600 L·h－1，離子源溫度為100℃，采用MSE采集方式，采集時間30 min，掃描范圍100～1 200 amu，掃描時間為0.1 s。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 取延胡索乙素對照品適量加甲醇制成每1 mL含延胡索乙素50μg對照品溶液。

2.3.2 混合對照品溶液的制備 取下述對照品，加甲醇制成分別含：鹽酸巴馬汀20μg、去氧延胡索甲素20μg、海罌粟堿20μg、延胡索乙素50μg、歐前胡素20μg的混合對照品溶液。

2.3.3 對照藥材溶液的制備 分別取延胡索對照藥材1.8 g、白芷對照藥材0.9 g，分別按“2.3.4”項下供試品溶液制備方法制得各單味對照藥材溶液；取延胡索對照藥材1.8 g、白芷對照藥材0.9 g，按“2.3.4”項下供試品溶液制備方法制得混合對照藥材溶液。

2.3.4 供試品溶液的制備 取各劑型裝量差異項下本品內(nèi)容物，研細，取約一次服用量，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入濃氨試液－乙酸乙酯（1∶20）溶液50 mL，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用濃氨試液－乙酸乙酯（1∶20）溶液補足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘渣加甲醇溶解，移至5 mL量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的選擇和優(yōu)化 延胡索中主要含有生物堿類成分，調(diào)節(jié)流動相的pH值，可使生物堿轉(zhuǎn)變?yōu)殛栯x子BH＋形式，在含水流動相中加入離子對試劑時，BH＋與流動相中離子對試劑（烷基磺酸鹽）的陰離子RSO3－結(jié)合生成不帶電荷的中性離子對，增加生物堿類成分與非極性固定相間的疏水性締合作用，使其與白芷中部分香豆素類成分保留時間集中，縮短分析時間，改善分離效果。本實驗考查了離子對試劑十二烷基磺酸鈉和庚烷磺酸鈉對樣品分離效果的影響，結(jié)果顯示，當(dāng)流動相中含有庚烷磺酸鈉時，樣品分離效果良好。

本實驗考查庚烷磺酸鈉濃度為5、10、15、20 mmol·L－1時對供試品中各特征峰保留值的影響，結(jié)果顯示當(dāng)庚烷磺酸鈉濃度為15 mmol·L－1時保留時間穩(wěn)定。并考察了水相pH＝3、pH＝4、pH＝5、pH＝6、pH＝6.3、pH＝6.4、pH＝6.5、pH＝6.7、pH＝7時對供試品中各特征峰保留值的影響，結(jié)果顯示當(dāng)流動相pH＝6.4時各特征峰分離度良好。

3.2 指紋圖譜

3.2.1 指紋圖譜的建立 以元胡止痛片、膠囊、軟膠囊、滴丸和顆粒5種劑型共15批樣品為對象，獲取所有樣品的色譜圖，選擇分離度良好，無干擾，且各個劑型中均含有的色譜峰為特征峰，最終選取了9個色譜峰作為特征峰。選擇保留時間居中的7號峰為參照峰，對照指紋圖譜見圖1。

圖1 對照指紋圖譜

3.2.2 特征峰成分分析 將各成分峰與已知對照品進行比對，可歸屬其中5個峰；另通過液相分離制備出未知成分的特征峰峰1、2、3、9，采用UPLC／ DAD／Q－TOF－MS技術(shù)，分析MS與MS／MS數(shù)據(jù)并參考文獻［6～9］對其進行了指認，結(jié)果見表2。

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 專屬性考察 取混合對照品溶液、延胡索藥材溶液、白芷藥材溶液、輔料溶液及各供試品溶液，按上述色譜條件測定，色譜圖見圖2。結(jié)果表明各特征峰保留時間對應(yīng)陰性無干擾，專屬性良好。

3.3.2 進樣精密度試驗 取元胡止痛片供試品溶液（批號：20111103），按上述色譜條件，分別進樣6次，測定。以延胡索乙素參照物相應(yīng)的峰為S峰，計算各峰相對保留值，考察儀器精密度。各特征峰的相對保留時間RSD均小于0.5%，相對峰面積RSD均小于5%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

表2 元胡止痛制劑指紋峰歸屬結(jié)果表

圖2 HPLC色譜圖

3.3.3 重復(fù)性試驗 取元胡止痛片供試品溶液（批號：20111103）6份，按上述色譜條件測定，以延胡索乙素參照物相應(yīng)的峰為S峰，計算各峰相對保留值，考察方法的重復(fù)性。各特征峰的相對保留時間RSD均小于0.8%，相對峰面積RSD均小于5%，結(jié)果表明方法的重復(fù)性好。

3.3.4 耐用性試驗 取元胡止痛片供試品溶液（批號：20111103），按上述色譜條件，考察了不同品牌的色譜柱：①Thermo Acclsim 120 C18，4.6 mm× 250 mm；②Shimadzu VP－ODS，4.6 mm×250 mm；③Waters Symmetry C18，4.6 mm×250 mm；不同型號HPLC儀：①Dionex U3000；②Shimadzu－20AD；③Waters e2695。以延胡索乙素參照物相應(yīng)的峰為S峰，計算各峰相對保留值，考察方法的耐用性。各特征峰的相對保留時間RSD均小于5%，相對峰面積RSD均小于5%，表明本方法的耐用性較好。

3.3.5 穩(wěn)定性試驗 元胡止痛片供試品溶液（批號：20111103），按上述色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進行測定，記錄色譜圖。以延胡索乙素參照物相應(yīng)的峰為S峰，計算各峰相對保留值，考察供試品溶液的穩(wěn)定性。各特征峰的相對保留時間RSD均小于4%，相對峰面積RSD均小于5%，表明在24h內(nèi)溶液穩(wěn)定。

3.4 指紋圖譜評價方法分析 目前HPLC指紋圖譜的評價方法主要有以下幾種：①選定參照峰，計算各特征峰的相對保留值。將收集的15批樣品，按“2.1”項下選定的分析條件進行檢測，分別記錄各批樣品的供試品色譜圖（見圖3）。將延胡索乙素（峰7）作為參照峰S，計算各峰相對保留值，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，各峰的相對保留時間穩(wěn)定，不同色譜柱、不同儀器均可重現(xiàn)，但相鄰峰的相對保留值在±5%波動范圍內(nèi)互相交叉，無法通過相對保留時間準確定位；②根據(jù)多批次、多劑型樣品合成對照指紋圖譜（見圖4），以中藥指紋圖譜相似度評價軟件計算相似度，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，該方法操作簡單，且能從整體上反映樣品優(yōu)劣，但對所收集的樣品批次要求較高，需全面覆蓋各個生產(chǎn)廠家各種劑型樣品，以免實驗結(jié)果不準確；③采用混合對照藥材圖譜作為對照圖譜（見圖5），結(jié)果見表4。結(jié)果表明，采用混合對照藥材作為隨行參照，使指紋圖譜的適用范圍更廣，操作簡單，更易于不同時間、不同實驗室的結(jié)果重現(xiàn)，但該方法對對照藥材要求較高，需保證各批次對照藥材間的相似度較高；④規(guī)定各特征峰與其對應(yīng)藥材色譜峰保留時間相同。供試品指紋圖譜中應(yīng)呈現(xiàn)9個特征峰，峰1、2、3、8、9應(yīng)與白芷對照藥材溶液相應(yīng)色譜峰保留時間相同，峰4、5、6、7應(yīng)與延胡索對照藥材溶液相應(yīng)色譜峰保留時間相同，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，樣品各特征峰保留時間與其相應(yīng)來源藥材峰保留時間一致，該方法同樣采用了對照藥材作為隨行對照，且不同批次對照藥材的相似度在一定范圍內(nèi)波動均可保證結(jié)果的重現(xiàn)性，適用性較強。

以上4種評價方法除第一種方法存在相鄰峰相對保留值交叉，不利于峰定位的問題外，其余各方法均能反映元胡止痛系列制劑質(zhì)量，并且各評價方法結(jié)果一致，表明該分析方法穩(wěn)定性好，適用性強。

圖3 15批樣品的HPLC指紋圖譜

表3 樣品各特征峰相對保留值

圖4 15批樣品合成對照圖譜

圖5 混合對照藥材圖譜

表4 樣品與合成對照圖譜及對照藥材圖譜相似度計算結(jié)果

表5 樣品與單味對照藥材色譜峰保留時間比對結(jié)果表

續(xù)表5：

4 總結(jié)

本實驗建立了穩(wěn)定的元胡止痛系列制劑指紋圖譜，該方法分析時間短，重現(xiàn)性好，適用性強，可作為元胡止痛系列制劑質(zhì)量控制的手段之一，并比較分析了4種HPLC指紋圖譜評價方法，各評價方法優(yōu)缺點突出，可作為指紋圖譜質(zhì)量標(biāo)準制定的參考。

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Study on fingerprint of Yuanhuzhitong series preparations

ZHENG Lu-lu1，2，DONG Yuan-wen2，HUANG Lei2，YANG Xi2，NIE Jing1
（1.Hubei Institute for Food and Drug Control，Wuhan 430064，China；2.College of Pharmaceutical Sciences，Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430065，China）

ObjectiveTo establish the unified fingerprint of Yuanhuzhitong series preparations by HPLC.MethodsThe chromatographic separation was performed on a Thermo Acclsim 120 C18（4.6 mm×250 mm，5μm）column by gradientelution with acetonitrile－methanol（4∶1）asmobile phase A and 25 mmol·L－1sodium acetate solution（contained sodium heptane sulfonate 15 mmol·L－1，adjusted pH to 6.4 with glacial acetic acid）asmobile phase B.The flow ratewas1 mL·min－1.The detection wavelength was 280 nm，and the column temperature was 35℃.Results9 common peaks on the fingerprint of Yuanhuzhitong preparations were indicated，among which 5 peaks were confirmed by contrast with reference substance，and the other 4 peaks were identified by Waters xevo G2 Q－Tof LC／MS.ConclusionThe method was less analysis time and reliable，it can be used for the quality control of Yuanhuzhitong series preparations.

Yuanhuzhitong；Fingerprint；UPLC／DAD／Q－TOF－MS

R284

：A

2095－5375（2014）03－0132－005

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項—中藥質(zhì)量標(biāo)準研究和信息化體系建設(shè)平臺課題中成藥標(biāo)準研究平臺建設(shè)（No.009ZX09308－004）

鄭露露，女，研究方向：藥物分析方法的研究與設(shè)計，E－mail：827051036＠qq.com

聶晶，女，研究生導(dǎo)師，主任藥師，研究方向：藥物分析方法的研究與設(shè)計，Tel：027－87270482，E－mail：niejingwh＠sina.com