沈陽地區(qū)奶牛乳房炎細菌分離鑒定與優(yōu)勢菌株藥敏試驗

孫芳芳，何劍斌

（沈陽農業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院，遼寧 沈陽 110866）

沈陽地區(qū)奶牛乳房炎細菌分離鑒定與優(yōu)勢菌株藥敏試驗

孫芳芳，何劍斌?

（沈陽農業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院，遼寧 沈陽 110866）

為更好地制定奶牛乳房炎防治措施，本研究采集了沈陽地區(qū)6個奶牛場289頭臨床型乳房炎患牛的乳樣進行細菌的分離鑒定，共分離得到4類9種細菌共計354株細菌，主要為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、乳房鏈球菌，并對高發(fā)的大腸桿菌菌株進行了19種常見抗生素的藥敏試驗，發(fā)現其對哌拉西林、氧氟沙星等高度敏感，對克林霉素、萬古霉素等高度耐藥。

奶牛乳房炎；細菌分離鑒定；大腸桿菌；藥敏試驗

奶牛乳房炎是奶牛最常見、最多發(fā)且經濟損失最大的疾病，該病廣泛存在于世界各地，是一個世界性的問題。發(fā)生乳房炎會造成奶牛的乳腺組織不同程度的損失或破壞，泌乳量大幅減少，乳品質下降，所含細菌也會危害飲用者的健康[1-2]。目前對奶牛乳房炎的防治措施主要集中在抗生素治療上，由于諸多原因，導致抗生素的濫用現象十分嚴重，耐藥菌株層出不窮，治療過程中效果不佳，成本增加，還會引起乳中藥物殘留，對公共衛(wèi)生以及食品安全造成一定的隱患。本研究采集了沈陽地區(qū)部分奶牛場臨床型乳房炎的奶樣，對其中引起乳房炎的細菌進行分離鑒定，并對主要細菌的耐藥性進行研究，旨在對引起本地區(qū)乳房炎的細菌進行系統(tǒng)的研究，為乳房炎的有效防治提供科學依據。同時為進一步的分子流行病調查提供材料。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基和生化試劑培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂、哥倫比亞血瓊脂基礎、營養(yǎng)肉湯、肉浸液、麥康凱瓊脂、伊紅美蘭瓊脂、DHL瓊脂、MH(A）培養(yǎng)基等購自北京奧博星生物技術有限公司；甘露醇氯化鈉瓊脂、緩沖葡萄糖蛋白胨、OF培養(yǎng)基、西蒙氏檸檬酸鹽、40%膽汁肉湯、動力-吲哚-尿素培養(yǎng)基等購自杭州天和微生物試劑有限公司。

生化試劑：脫纖綿羊血購自南京便診生物科技有限公司；革蘭氏染色液、吲哚試劑、VP甲液、VP乙液、甲基紅試劑、馬尿酸鹽試劑等購自杭州天和微生物試劑有限公司。

生化反應管：七葉苷、馬尿酸鈉生化管、水楊素、山梨醇、麥芽糖、木糖、pH9.6肉湯、6.5%高鹽肉湯、苦杏仁苷、阿拉伯糖、棉籽糖、山梨醇、肌醇、DNA、鳥氨酸、氨基酸脫羧酶、血清菊糖、膽汁七葉苷、鼠李糖、硫化氫、蜜二糖、枸櫞酸鹽、β-半乳糖苷（ONPC）、紫牛乳、水楊酸、硝酸鹽（還原）、0.1%美蘭牛乳等購自杭州天和微生物試劑有限公司。

藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 乳樣采集根據乳房炎判定標準[3]，分別從沈陽周邊6個奶牛場采集臨床型乳房炎奶樣289份，患牛均處于泌乳期。采樣前，用溫水清洗乳房后用75%酒精進行消毒，棄去頭三把奶以排除環(huán)境微生物的污染[4]。將采集奶樣收集在裝有2 mL滅菌營養(yǎng)肉湯的小試管后，封裝，標記牛號，帶回實驗室后37℃培養(yǎng)18 h后進行分離鑒定。

1.3 細菌的分離鑒定用接種環(huán)取培養(yǎng)后的菌液1鉑耳環(huán)在綿羊血瓊脂平板上劃線接種，觀察培養(yǎng)24～72 h。取形態(tài)與溶血環(huán)不同的單個菌落劃線接種于普通瓊脂，并涂片革蘭氏染色鏡檢，反復此過程直到培養(yǎng)出單個純菌落。對于在普通瓊脂上不生長的菌株，則繼續(xù)用血瓊脂平板劃線純培養(yǎng)。

將純培養(yǎng)菌落分別劃線接種于高鹽甘露醇培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基，根據鏡檢結果、培養(yǎng)特性與選擇性培養(yǎng)基初步判定，將分離純化的細菌分別進行不同的生化鑒定試驗。其中對在高鹽甘露醇生長，在麥康凱不生長的短桿菌，利用葡萄球菌科細菌生化編碼手冊進行鑒定；對在麥康凱生長，在高鹽甘露醇不生長的球菌，利用腸桿菌屬細菌生化編碼冊進行鑒定；以《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》《伯杰細菌鑒定手冊》[5-7]等為依據，對其他細菌進行鑒定。

1.4 主要細菌藥敏試驗為保證分離鑒定的準確性，將分離得到的優(yōu)勢菌株送上海生工進行16srNA測序，結果正確后進行藥敏試驗，采用國際通用的KB紙片擴散法[8]。取純培養(yǎng)菌落接種于營養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)18～24 h，對達到0.5麥氏比濁度的菌液進行藥敏試驗。用滅菌長棉簽沾取菌液，并在試管壁輕輕按壓以擠出多余菌液，用長棉簽均勻涂布MH瓊脂平板，待瓊脂表面干燥后，將藥敏片用無菌鑷子等距離貼在瓊脂平板上[9]。37℃培養(yǎng)24 h后，用游標卡尺測量抑菌環(huán)直徑，依據NCCLS抗菌藥物藥敏紙片判斷標準和解釋，判定其對各類藥物的敏感性，分別記做高度敏感（S），中度敏感（I），耐藥為（R）。

2 試驗結果與分析

2.1 主要細菌分離鑒定結果從289份臨床乳房炎患牛奶樣中共檢出4類19種細菌，共計354株。細菌種類分別為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、乳房鏈球菌、肺炎克雷伯菌、化膿鏈球菌、表皮葡萄球菌、其他革蘭氏陽性桿菌、志賀菌屬、木糖葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌、產酸克雷伯氏菌、腐生葡萄球菌、牛棒狀桿菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌、糞鏈球菌、產氣芽胞梭菌、變形桿菌屬。其中大腸桿菌63株，占比19.7%；金黃色葡萄球菌49株，占比15.4%，無乳鏈球菌39株，占比12.2%。266份樣本檢出單一細菌，占比92.0%，21份樣本檢出2～3種細菌，占比7.2%，2份樣本無檢出。

結果表明，感染奶牛乳房炎的病原微生物主要為大腸桿菌，其次為金黃色葡萄球菌與無乳鏈球菌。奶牛乳房炎的發(fā)病多以單一感染為主，由兩種或兩種以上細菌混合感染的情況相對較少。

2.2 大腸桿菌生物學特性鑒定結果見表1。

表1 大腸桿菌主要生物學特性Table1 The main biological characteristics of E.coli

大腸桿菌不同菌株的生化反應結果并不相同。符合枸櫞酸鹽、吲哚、與葡萄糖產氣標準判定結果的大腸桿菌的比例低于90%，差異性較大。甘露醇、山梨醇、阿拉伯糖、木糖、H2S的結果符合率為100%，無差異。

2.3 大腸桿菌藥敏試驗結果見表2。

表2 大腸桿菌藥敏試驗結果Table2 Results of E.coli susceptibility test %

從表2中可以看出，大腸桿菌對臨床常用的抗生素均產生了不同程度的耐藥性，其中耐藥程度最高的分別為克林霉素、萬古霉素、青霉素，耐藥率分別為78%、75%、65%。對哌拉西林、氧氟沙星、鏈霉素、諾氟沙星有較高的敏感性，敏感度分別為75%、72%、66%、66%，可作為臨床參考用藥。

3 討論

奶牛乳房炎由多種病原微生物引起，不同地區(qū)、同一地區(qū)不同奶牛場的發(fā)病情況也有所不同[10-11]，這也是進行區(qū)域乳房炎流行病學調查的根本出發(fā)點。在對沈陽地區(qū)289份的奶樣的病原微生物進行分離鑒定后，發(fā)現大腸桿菌的檢測率超過金黃色葡萄球菌，為導致本地區(qū)乳房炎感染的主要細菌。大腸桿菌一般來自環(huán)境，要根除環(huán)境細菌性乳房炎是很困難的。這也提示了本地區(qū)飼養(yǎng)管理、環(huán)境衛(wèi)生等環(huán)節(jié)存在一定問題。因此防控奶牛乳房炎，要從根本上改變管理不完善、衛(wèi)生不整潔、消毒不徹底、擠奶不科學和干奶不合理等的現狀。

目前，對于奶牛乳房炎的治療國內外仍然以抗生素為主，但長期的濫用與亂用抗生素導致了大量耐藥菌株的出現[12]。從試驗結果可知，導致奶牛乳房炎的大腸桿菌對常用的抗生素已經產生了不同程度的耐藥性，其中耐藥程度最高的分別為克林霉素、萬古霉素、青霉素等，長期以來牛場慣于采用的干奶期使用青霉素封閉乳頭的做法，導致了沒有任何一株分離得到的大腸桿菌對其高度敏感。這與國內外報道的結果基本一致[13-15]。防治奶牛乳房炎，不僅要做到科學管理從源頭上杜絕微生物感染，還要合理選用抗生素。避免長期頻繁使用同一種或同一類抗生素，要做到交叉用藥，中西藥結合治療也有很好的效果[16]，盡量減少抗生素使用量。預防重于治療，治療做到科學系統(tǒng)有原則，才能有效控制奶牛乳房炎的發(fā)生。

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（編輯：韓斌）

Bacteria isolation and identification of cow mastitis and antibiotic sensitivity testof the predom inantstrains in Shenyang area

Sun Fangfang,He Jianbin*
（Col lege of Animal Science and veterinary medicine,Shenyang Agricultural University, Liaoning Shenyang 110866）

In order to bet ter develop prevention measures of cow mastitis,6,289 mi lk samples f rom dairy cows suf fering f rom cl inical mastitis in Shenyang area were col lected and used for bacterial isolation and identi f ication.Four classes total ing 3,549 kinds of bacteria were isolated, mainly Escherichia coli,Staphylococcus aureus,St reptococcus agalactiae,and St reptococcus uberis.The antibiotic sensitivity test revealed that E.col i st rains were highly sensitive to piperacil l in,of loxacin,clindamycin,and vancomycin.

Cowmastitis;bacterial isolation and identi fication;E.col i;susceptibi lity testing

S852.61

：B

：1672-9692(2014)02-0044-04

2013-12-31

孫芳芳（1982-），女，碩士研究生，研究方向奶牛疾病防治。

何劍斌（1969-），男，博士，教授，主要研究方向奶牛疾病防治。