參姜鎖陽益氣片對寒凝氣滯血瘀證大鼠下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸及中樞神經(jīng)遞質(zhì)的影響

賈丹兵，于 淼，李乃民，唐立明，李春杰，朱 宇，劉 珊

參姜鎖陽益氣片由西洋參、白術(shù)、桂枝、干姜、麥冬、補(bǔ)骨脂等組成，具有聚宗氣、暖身體、溫五臟、耐寒冷等作用。藥理實(shí)驗(yàn)研究證明，參姜鎖陽益氣片可以調(diào)控寒凝氣滯血瘀證大鼠血液中6-酮前列腺素 F1α(6-keto-PGF1α)、血栓素 2(TXB2)水平并能改善模型大鼠氧自由基代謝［1］。臨床實(shí)踐表明參姜鎖陽益氣片能提高高寒地區(qū)運(yùn)動性疲勞人群的耐寒及抗缺氧能力［2］。中醫(yī)理論認(rèn)為，寒邪所造成的血液滯澀、經(jīng)脈血瘀、五臟受損，不能單純衛(wèi)外，應(yīng)治五臟皆有之中寒［3］。本研究采用不同劑量參姜鎖陽益氣片對寒凝氣滯血瘀證大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，從下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸及中樞神經(jīng)遞質(zhì)等方面探討該藥物的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級SD大鼠36只，雄性，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供［許可證號SCXK(黑)2008004］，體重(200 ±20)g，常規(guī)條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及藥品

1.2.1 主要儀器:Ht2型酶標(biāo)儀、洗板機(jī)(奧地利博塞)，TGL-16G臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，BRAND系列單道可調(diào)移液器(德國)。

1.2.2 主要藥品及試劑:參姜鎖陽益氣片由西洋參、白術(shù)、桂枝、干姜、麥冬、補(bǔ)骨脂等組成，將處方中藥材按一定比例配好后密封罐蒸煮加壓，用水提取法濃縮、噴霧、干燥，獲取精純浸膏粉藥，制成片劑，每片0.40 g(含有效成分0.35 g，批號:20100702);大株紅景天膠囊由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)(批號:081108);鹽酸腎上腺素注射液(天津金耀氨基酸有限公司，批號:1007121);水合氯醛(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司);垂體前葉促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、腎上腺皮質(zhì)酮(CORT)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(北京尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司);5-羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，其他常規(guī)化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物分組與模型制備:隨機(jī)選取6只大鼠為A組，其余30只大鼠采用腎上腺素加冰水浴復(fù)合低溫冷凍法建立寒凝氣滯血瘀證大鼠模型［4］。方法如下:大鼠皮下注射0.1%鹽酸腎上腺素0.08 ml/100 g，注射2次，間隔4 h，第1次注射給藥后2 h將大鼠置4℃冰水浸泡5 min，于第2天將大鼠分別放入低溫冷柜鼠籠中，在-20℃的冷環(huán)境中持續(xù)受凍4 h，每日1次，連續(xù)7日。將造模成功的30只大鼠隨機(jī)分為 B、C、D、E、F組，每組各6只，分別編號、標(biāo)記、稱重。

1.3.2 給藥方法:各組在末次造模后1 h，灌胃給藥，每日1次，連續(xù)給藥2周，給藥劑量按成人每日每公斤體重用量進(jìn)行折算如下:C、D、E組分別給予參姜鎖陽益氣片70、140、280 mg/kg;F組給予大株紅景天膠囊280 mg/kg;A、B組分別給予等體積生理鹽水。

1.3.3 血中ACTH、CORT水平檢測:在相應(yīng)時間點(diǎn)，各組大鼠禁食不禁水12 h，10%水合氯醛腹腔麻醉，腹主動脈取血3 ml，3000 r/min離心10 min，分離血清，-70℃保存用于檢測，成批測定，以免產(chǎn)生批間差。檢測方法嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.4 腦組織勻漿中DA、5-HT和NE含量檢測:取血完成后，迅速開胸暴露心臟，從左心室插管至升主動脈根部，在右心耳剪開一小口做出口。4℃生理鹽水200 ml快速灌注，之后稍減慢灌注速度沖洗至流出液清亮，大鼠斷頭后快速于冰盤上取出全腦，分離出海馬和下丘腦，迅速放入液氮中備用。腦組織樣品放入研磨器中，加入液氮并研成精細(xì)的粉末，待液氮揮發(fā)后稱重，以10倍體積的生理鹽水溶解，在冰浴下制備成組織勻漿液，3500 r/min離心10 min，取上清液，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.5 ELISA檢測:操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行:①使用前將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量泡沫，以免加樣時產(chǎn)生誤差。②將樣本用樣本稀釋液1∶1稀釋后加入50μl于各反應(yīng)孔中，每個樣本做一個平行樣。③加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品50μl于反應(yīng)孔，加入待測樣品50μl于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50μl生物素標(biāo)記抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃孵育1 h。④甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)3次。⑤每孔加入60μl親和鏈霉素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃孵育30 min。⑥甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)操作3次。⑦每孔加入底物A、B各50μl，輕輕振蕩混勻，37℃孵育10 min，避免光照。⑧取出酶標(biāo)板，迅速加入50μl終止液，并立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定各孔吸光度(OD)值。

1.3.6 結(jié)果計(jì)算:以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以待測指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制相應(yīng)的曲線，根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 血中ACTH、CORT水平 與A組比較，B組ACTH、CORT水平均升高(P＜0.01);與B組比較，C、D、E、F組血清中 ACTH、CORT水平均有不同程度的降低(P＜0.05，P＜0.01)，以D、E組變化最顯著(P＜0.01);與F組比較，E組血中 ACTH、CORT水平降低，C組血中 CORT水平顯著升高(P＜0.01)，D組血中 ACTH、CORT水平和 C組血中ACTH水平與F組比較無差異(P＞0.05)，見表1。

表1 6組大鼠血中垂體前葉促腎上腺皮質(zhì)激素、腎上腺皮質(zhì)酮水平(x ± s，pg/ml)

2.2 腦組織勻漿中DA、5-HT和NE含量 與A組比較，B組腦組織勻漿中DA、5-HT和NE含量升高(P ＜0.01);與 B 組比較，除 C、D 組 DA 外，C、D、E、F組腦組織勻漿中DA、5-HT和NE含量均降低(P＜0.05，P＜0.01)，以E 組變化最顯著(P ＜0.01);與 F組比較，C組腦組織勻漿中DA、5-HT和NE含量均升高，E組腦組織勻漿中DA含量降低(P＜0.05);D組腦組織勻漿中DA、5-HT、NE含量和E組5-HT、NE含量與F組比較無差異(P＞0.05)，見表2。

3 討論

下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸是動物參與應(yīng)激反應(yīng)最重要的調(diào)控體系。寒冷環(huán)境下，ACTH分泌增多，使腎上腺皮質(zhì)激素分泌增加［5］，加速細(xì)胞能量代謝、肝糖原分解、糖原異生，這些反應(yīng)對提高組織代謝、增加產(chǎn)熱、維持體溫都具有重要的作用［6］。中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)參與體溫調(diào)節(jié)活動，并且是溫度敏感神經(jīng)元活動的神經(jīng)化學(xué)基礎(chǔ)。體溫調(diào)節(jié)的單胺學(xué)說認(rèn)為5-HT和NE這兩種物質(zhì)在量上的動態(tài)平衡可以保持體溫的恒定［7］。王洪琦等［8］研究表明，體溫偏高的大鼠，其視前區(qū)-下丘腦前部腦組織中的DA含量明顯高于正常大鼠，提示DA參與體溫的調(diào)節(jié)。

表2 6組大鼠腦組織勻漿中多巴胺、5-羥色胺和去甲腎上腺素含量變化(x ± s，pg/ml)

參姜鎖陽益氣片方中以西洋參、白術(shù)、桂枝、干姜為君藥，溫中祛寒行血，重在針對高寒缺氧所致的寒厥氣衰;以麥冬、補(bǔ)骨脂、淫羊藿等為臣藥，益肺補(bǔ)腎，以御寒邪直傷五臟六腑之功;以鎖陽、紅花等為佐藥，祛除寒邪所致臟腑缺血少氣之諸癥;以鹿茸、蓽拔為使藥，陽中益陰又調(diào)和諸藥。大株紅景天具有益氣活血通脈的功效［9］，作為臨床肯定程度較高的一類活血化瘀藥物［10］，其對患者血液循環(huán)狀態(tài)的影響作用日益受到肯定。有研究顯示紅景天同時具有抗血小板聚集、促進(jìn)組織纖維蛋白溶酶的活性、降低血液的黏度、提高血液中血栓溶解、改善血液血流的藥理作用［11-12］，紅景天能夠提高機(jī)體耐缺氧和抗疲勞能力，提高抗寒力，降低整體耗氧量［13-14］。亦有研究表明，紅景天具有調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的藥理作用［15］，在預(yù)防、治療腦部缺血和神經(jīng)退行性疾病方面具有潛在價值［16］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與A組比較，B組血中ACTH和CORT水平明顯升高，同時中樞神經(jīng)遞質(zhì)DA、5-HT和NE的含量也有所增加。提示寒冷刺激可引發(fā)機(jī)體下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸興奮。在應(yīng)激反應(yīng)中，一定范圍內(nèi)激素水平和中樞神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化可以幫助機(jī)體緩沖和適應(yīng)應(yīng)激刺激，因此開始時這是機(jī)體一種保護(hù)性反應(yīng)，但較高的激素水平和中樞神經(jīng)遞質(zhì)含量的長時間作用可以對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生損害［17］。經(jīng)不同劑量參姜鎖陽益氣片治療后，大鼠血中ACTH和CORT水平和中樞神經(jīng)遞質(zhì)DA、5-HT和NE的含量均有不同程度的下降。本研究結(jié)果還顯示，與F組比較，C組血中CORT水平和腦組織勻漿中DA、5-HT和NE含量升高。E組血中ACTH、CORT水平降低，而D組血中 ACTH、CORT水平和腦組織勻漿中5-HT、DA和NE含量與F組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示在抗寒冷護(hù)機(jī)體方面D組與F組療效最相近，從而初步確定了參姜鎖陽益氣片抗寒冷護(hù)機(jī)體的大致用量。

綜上所述，參姜鎖陽益氣片能夠通過下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸調(diào)節(jié)有關(guān)激素的水平，同時能調(diào)節(jié)相關(guān)中樞神經(jīng)遞質(zhì)的含量，從而調(diào)控體溫，起到對機(jī)體的保護(hù)作用。這可能是參姜鎖陽益氣片預(yù)防和治療寒凝氣滯血瘀證的又一作用機(jī)制。此外，通過與中藥大株紅景天比較，初步明確了參姜鎖陽益氣片抗寒冷護(hù)機(jī)體的劑量。

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