參姜鎖陽益氣片對寒凝氣滯血瘀證大鼠腦組織中ATP酶和核苷酸的影響

賈丹兵，鞏沅鑫，李乃民，唐立明，李春杰，劉 珊，魏 博

血瘀證是指血液循環(huán)遲緩，或流行不暢，甚則血液瘀結(jié)停滯成積的病理狀態(tài)，于我國東北地區(qū)常見，長期困擾人們的工作和生活。我們根據(jù)中醫(yī)學(xué)理論，對寒凝氣滯血瘀證這一病癥的某些特征進(jìn)行模擬復(fù)制，創(chuàng)造出具有人工疾病和證的動(dòng)物模型，并應(yīng)用自主研發(fā)的參姜鎖陽益氣片對動(dòng)物模型進(jìn)行治療，探討參姜鎖陽益氣片對寒凝氣滯血瘀證大鼠模型腦組織中ATP酶和核苷酸的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型制備 選取清潔級SD大鼠［由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號 SCXK(黑)2008004］60只，雄性，體重(200±20)g。隨機(jī)選取12只大鼠作為A組，其余48只采用腎上腺素加冰水浴復(fù)合低溫冷凍法，建立寒凝氣滯血瘀證大鼠模型［1-2］。方法如下:大鼠在第1天先采用皮下注射0.1%鹽酸腎上腺素0.08 ml/100 g，共注射2次，間隔4 h，第1次注射給藥后2 h將大鼠置于4℃冰水浸泡5 min;于第2天將大鼠分別放入低溫冷柜小鼠籠中，在-20℃的冷環(huán)境中持續(xù)受凍4 h，每日1次，連續(xù)7次，造模成功后隨機(jī)分為B、C、D、E 組，每組12只。

1.2 方劑成分及劑量的確定 參姜鎖陽益氣片(由解放軍211醫(yī)院提供，批號:20100702)，成分為西洋參、桂枝、紅花、干姜、鎖陽等［3］。組方劑量根據(jù)《中華人民共和國藥典》2005版規(guī)定的劑量要求和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物急性毒性實(shí)驗(yàn)的擬用劑量來確定。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 造模結(jié)束后第2天開始，C、D、E組按體重計(jì)算分別應(yīng)用不同濃度，相同體積的參姜鎖陽益氣片水溶液灌胃給藥，給藥劑量分別為70、140、280 mg/kg，A、B組給予等體積的生理鹽水。每天1次，連續(xù)給藥14 d。給藥結(jié)束后第2天，各組大鼠應(yīng)用戊巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉，迅速開胸暴露心臟，從左心室插管至升主動(dòng)脈根部，在右心耳剪開一小口做出口。4℃生理鹽水200 ml快速灌注，之后稍減慢灌注速度沖洗至流出液清亮，大鼠斷頭后快速于冰盤上取出全腦，分離出海馬和下丘腦，迅速放入液氮中備用。

1.3.1 ATP酶活力檢測:將分離出的一半腦組織樣品放入研磨器中，加入液氮并研成精細(xì)的粉末，待液氮揮發(fā)后稱重，以10倍體積的生理鹽水溶解，在冰浴下制備成組織勻漿液，3500 r/min離心10 min，取上清液，應(yīng)用南京建成生物工程研究所提供的ATP酶測試盒進(jìn)行酶活力測定，將100μl上清液加入130μl反應(yīng)液中，混勻，37℃水浴10 min后，加入鉬酸銨50 μl，混勻，3000 ～4000 r/min離心10 min，取100μl上清液加入2000μl定磷劑定磷。45℃水浴20 min，冷卻至室溫后，在660 nm波長下，1 cm光徑，分光光度法比色。

1.3.2 核苷酸活性測定:將另一半腦組織樣品放入研磨器中，加入液氮并研成精細(xì)的粉末，待液氮揮發(fā)后稱重，以 10倍體積的 Tris-HCL緩沖液(0.05 mol/L，pH=7.4)溶解，在冰浴下制備成組織勻漿液，3500 r/min離心10 min，取上清液，應(yīng)用雙抗體夾心(試劑盒由南京建成生物工程研究所提供)檢測腦組織中環(huán)腺甘酸(cAMP)、環(huán)鳥苷酸(cGMP)、腺苷酸環(huán)化酶(AC)、磷酸二酯酶(PDE)濃度。AC活性測定的cpm值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可算出每分鐘每毫克組織分解ATP生成cAMP的量為其活性單位［pmol/(mg·min)］。PDE活性測定用每分鐘每毫克組織水解3H-cAMP的百分轉(zhuǎn)化率表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 ATP酶活力 與A組比較，B組海馬區(qū)和下丘腦組織中 Ca2+-ATP、Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力均降低(P＜0.05);與B組比較，除C組下丘腦Ca2+-ATP、Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP和 D 組下丘腦Na+-K+-ATP酶活力外，C、D、E組海馬區(qū)及下丘腦組織ATP酶活力均不同程度升高，且呈劑量依賴性，以E組變化最明顯(P＜0.05，P＜0.01)，見表1。

2.2 核苷酸活性 與A組比較，B組海馬和下丘腦組織中cAMP、cGMP、AC活性降低，PDE活性升高(P＜0.05);與 B組比較，除 C組海馬區(qū) cAMP、cGMP和下丘腦組織中cAMP外，C、D、E組海馬和下丘腦cAMP、cGMP、AC均升高，PDE活性均降低，且呈劑量依賴性，以E組變化最明顯(P＜0.05，P＜0.01)，見表2。

表1 5組大鼠海馬及下丘腦組織中ATP酶活力變化(x ± s，n=12)

表2 5組大鼠海馬及下丘腦組織中核苷酸活性變化(x ± s，n=12)

3 討論

當(dāng)外界溫度過低超過人體的生理調(diào)節(jié)能力或人體在寒冷環(huán)境中暴露時(shí)間過長時(shí)，寒冷刺激可以導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)遲鈍、身體疲勞，使體能消耗與作業(yè)效能降低同時(shí)并存。Ca2+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、Na+-K+-ATP是廣泛存在于各類細(xì)胞細(xì)胞膜上的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其正常的生理活動(dòng)對于維持細(xì)胞內(nèi)外各種離子不同的濃度梯度至關(guān)重要［4-8］。當(dāng)這些膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能受損時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激性和傳導(dǎo)性下降，無法及時(shí)、準(zhǔn)確地將上游神經(jīng)中樞的控制信號傳遞給效應(yīng)器，同時(shí)，也無法將感受器接收到的各種刺激信號上傳至各級神經(jīng)中樞，使機(jī)體無法迅速對外界刺激作出相應(yīng)的反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致一系列病理現(xiàn)象的發(fā)生。cAMP、cGMP作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使廣泛參與細(xì)胞內(nèi)多種生理、生化反應(yīng)和細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)［9-13］，其含量變化受AC和PDE活性的雙重調(diào)節(jié)。cAMP和cGMP是AC分別催化ATP和GTP脫去一個(gè)焦磷酸后的產(chǎn)物，且cAMP與cGMP能夠被PDE 迅速水解為無活性的 5＇-AMP 與 5＇-GMP［8］，進(jìn)而失去信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。當(dāng)cAMP、cGMP含量發(fā)生改變時(shí)，導(dǎo)致下游信號蛋白PKA的激活作用減弱，進(jìn)而影響下游絲氨酸、蘇氨酸殘基的磷酸化激活或鈍化，影響機(jī)體相關(guān)調(diào)控信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)各種病理狀態(tài)。

參姜鎖陽益氣片主要由西洋參、淫羊藿、鎖陽、桂枝、干姜、紅花等組成，具有補(bǔ)脾、益腎、溫肺、強(qiáng)二本、聚宗氣、溫五臟、耐寒冷、增體力、旺精神之功效，使人體五臟六腑整體功能增強(qiáng)，提高人體正氣，增強(qiáng)免疫功能，防止臟腑器官功能減退。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與A組比較，B組腦組織中Ca2+-ATP、Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP 酶和 AC的活力顯著下降，cAMP和cGMP含量減少，PDE轉(zhuǎn)化率明顯升高。這可能是由于寒凝氣滯血瘀狀態(tài)下，機(jī)體氣血運(yùn)行不暢，甲狀腺、腎上腺皮質(zhì)功能降低，內(nèi)分泌激素作用于AC，使AC活化功能降低，導(dǎo)致cAMP和cGMP生成受阻，進(jìn)而影響機(jī)體的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能［14］。本研究結(jié)果還顯示，與B組比較，參姜鎖陽益氣片能夠有效提高腦組織中Ca2+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、Na+-K-+-ATP 酶活力及大鼠腦組織中cAMP和cGMP含量，增強(qiáng)AC活力，降低PDE轉(zhuǎn)化率，提示參姜鎖陽益氣片能使細(xì)胞內(nèi)外各種離子濃度差向正常狀態(tài)恢復(fù)，增強(qiáng)細(xì)胞應(yīng)激性和傳導(dǎo)性，使cAMP和cGMP活性提高并恢復(fù)及其下游信號功能，從而起到腦保護(hù)的作用。

綜上所述，參姜鎖陽益氣片能夠有效治療因寒凝氣滯血瘀證所導(dǎo)致的機(jī)體應(yīng)激功能失調(diào)，恢復(fù)腦部離子通道功能，提高細(xì)胞內(nèi)重要信使分子cAMP和cGMP活性，使腦細(xì)胞保持功能活躍狀態(tài)，起到腦保護(hù)的作用。

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