參姜鎖陽(yáng)益氣片對(duì)寒凝氣滯血瘀證大鼠腦細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

賈丹兵，劉 珊，李乃民，唐立明，李春杰，于 淼，鞏沅鑫，魏 博

參姜鎖陽(yáng)益氣片是由西洋參、桂枝、紅花、干姜、鎖陽(yáng)等組成的中藥制劑，具有溫?zé)犰詈?，通?jīng)活絡(luò)，益肺補(bǔ)腎，調(diào)炅散瘀之功效。該藥物制備工藝穩(wěn)定［1-2］，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可靠［3］。本研究觀察參姜鎖陽(yáng)益氣片對(duì)寒凝氣滯血瘀證大鼠海馬區(qū)和下丘腦細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白bax、bcl-2和capase-3表達(dá)的影響，探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠48只，雄性，體重(200±20)g。由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［許可證號(hào):SCXK(黑)2008004］。常規(guī)條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及藥品

1.2.1 主要儀器:電子天平(上海梅德勒公司)，電熱恒溫箱(上海一恒)，2135型組織切片機(jī)(德國(guó)徠卡)，醫(yī)用微波爐(日本松下)，Moticam 3000顯微攝影成像系統(tǒng)(美國(guó)Motic)，Motic Med 6.0病理圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)Motic)。

1.2.2 主要藥品與試劑:參姜鎖陽(yáng)益氣片(規(guī)格:350 mg，由解放軍211醫(yī)院提供，批號(hào):20100702)，大株紅景天膠囊(規(guī)格:0.38 g，江蘇康緣藥業(yè)，批號(hào):081108)，鹽酸腎上腺素(天津金耀批號(hào):1007121)，水合氯醛(天津科密歐)。兔抗bcl-2、bax和caspase-3多克隆抗體(武漢博士德)，PV6001兩步法二抗、DAB顯色劑(北京中杉)，其他為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物分組與模型制備 隨機(jī)選取8只正常大鼠為A組，其余40只大鼠采用腎上腺素加冰水浴復(fù)合低溫冷凍法［4］，建立寒凝氣滯血瘀證大鼠動(dòng)物模型。方法如下:大鼠禁水12 h，第1天，先采用皮下注射0.1%鹽酸腎上腺素0.8 ml/kg，共注射2次，間隔4 h，第1次注射給藥后2 h將大鼠置4℃冰水浸泡5 min。于第2天將大鼠分別放入低溫冷柜小鼠籠中，在-20℃的冷環(huán)境中持續(xù)受凍4 h左右。待大鼠出現(xiàn)寒戰(zhàn)，畏寒喜暖，蜷縮少動(dòng)，朦朧欲睡，眼中無(wú)神，反應(yīng)遲鈍，呼吸微弱，皮毛蓬松樹立無(wú)光澤，小便色淡，大便濕爛，唇周發(fā)黑，耳色暗紅，爪尾部紫暗，舌暗紅等癥狀和體征時(shí)將大鼠取出冷柜。每日9:00～13:00冷凍1次，連續(xù)冷凍7次。將造模成功的40只大鼠隨機(jī)分為B、C、D、E、F組，每組8只，各組在末次造模后1 h灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥2周，給藥劑量按成人每日每公斤體重用量進(jìn)行折算如下:C、D、E組分別給予參姜鎖陽(yáng)益氣片70、140、280 mg/kg;F組給予大株紅景天膠囊280 mg/kg;A、B組均給予等體積生理鹽水。

1.4 bcl-2、bax和capase-3表達(dá)檢測(cè)

1.4.1 標(biāo)本采集方法:各組大鼠應(yīng)用戊巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉，迅速開胸暴露心臟，從左心室插管至升主動(dòng)脈根部，在右心耳剪開一小口做出口。4℃生理鹽水200 ml快速灌注，之后稍減慢灌注速度沖洗至流出液清亮，斷頭后快速于冰盤上取出全腦，放入4%多聚甲醛溶液中固定，分別取海馬與下丘腦組織，常規(guī)石蠟包埋，切片厚5μm，用于免疫組化染色。

1.4.2 免疫組化PV二步法:切片常規(guī)脫蠟到水，3%過(guò)氧化氫溶液(H2O2)孵育10 min，PBS沖洗2 min 3次，微波修復(fù):切片入枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6)，微波爐中5 min 2次，間隔10 min。冷卻至室溫，滴加一抗，4℃冰箱中過(guò)夜，PBS沖洗2 min 3次，滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗2 min 3次，DAB顯色5～10 min。蒸餾水充分沖洗，蘇木素復(fù)染1 min，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.4.3 分析方法:采用Motic Med 6.0病理圖像分析系統(tǒng)，對(duì)免疫組化染色切片進(jìn)行分析。在400倍鏡下每個(gè)切片觀察4個(gè)高倍視野，經(jīng)顯微鏡攝像儀攝入，按512×512像素分布，并保存在病理圖像分析系統(tǒng)內(nèi)，用免疫組化分析模塊進(jìn)行分析，先進(jìn)行分割，選擇點(diǎn)狀分割將陽(yáng)性物標(biāo)記為棕黃色，除去非特異染色，計(jì)算出陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)目，取其平均值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化 大鼠海馬區(qū)和下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)在胞質(zhì)中呈現(xiàn)黃色或棕黃色，顏色由深到淺，以神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)最明顯，見(jiàn)圖1～6。

2.2 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 與A組比較，B組海馬區(qū)和下丘腦bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯降低，bax和capase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加(P＜0.01);與B組比較，除C組下丘腦bcl-2外，C、D、E、F組海馬區(qū)和下丘腦bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞不同程度升高，而bax和capase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均有不同程度的降低(P＜0.05，P＜0.01);與F組比較，C、D、E組海馬區(qū)的bax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)升高(P＜0.05，P＜0.01)，海馬區(qū) bcl-2、caspase-3和下丘腦區(qū)bcl-2、bax、caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

3 討論

《內(nèi)經(jīng)》中記載:“肺朝百脈，輸精于皮毛，本末之寒溫相守司也，是謂平人。寒氣入經(jīng)而稽留，寒獨(dú)留則血凝泣，血凝泣則脈不通?！爆F(xiàn)代研究表明，寒冷刺激首先使身體淺表的微動(dòng)脈及小動(dòng)脈收縮，表層血流減少，皮膚因之變?yōu)樯n白色。同時(shí)動(dòng)靜脈吻合支開放增多，血液向靜脈回流加快，導(dǎo)致局部組織缺血缺氧，甚至壞死。寒冷刺激引起微循環(huán)障礙，血液黏度增高，血栓凝集導(dǎo)致血流瘀塞。我們采用腎上腺素加冰水浴復(fù)合低溫冷凍法制備寒凝氣滯血瘀證動(dòng)物模型，更能接近機(jī)體在高寒缺氧環(huán)境下的病理過(guò)程，符合中醫(yī)證候特點(diǎn)，也與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的觀點(diǎn)相一致，且該模型具有操作方法簡(jiǎn)單，模型穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。

細(xì)胞凋亡也稱程序性細(xì)胞死亡，是細(xì)胞接受生理或病理信號(hào)刺激后啟動(dòng)的一種主動(dòng)消亡過(guò)程，是保持組織細(xì)胞自穩(wěn)態(tài)的一個(gè)基本過(guò)程，但過(guò)度凋亡則導(dǎo)致組織損傷，進(jìn)而引起功能障礙［5］。細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制是多方面的，其中細(xì)胞因子和bcl-2家族等對(duì)細(xì)胞凋亡有重要的調(diào)控作用。有研究表明細(xì)胞凋亡是多基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程，受促凋亡基因和抑凋亡基因的協(xié)同控制。bcl-2和bax作為一對(duì)關(guān)系密切的凋亡相關(guān)基因，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中均有表達(dá)，在神經(jīng)細(xì)胞凋亡的控制中起重要作用［6］。bcl-2基因有促進(jìn)細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的能力，其過(guò)度表達(dá)可特異性抑制細(xì)胞凋亡。bax基因的過(guò)度表達(dá)能加速白介素3(IL-3)細(xì)胞株在細(xì)胞因子缺失時(shí)發(fā)生細(xì)胞凋亡，并對(duì)抗bcl-2對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡［7］。即bcl-2大量表達(dá)時(shí)，形成bcl-2同源二聚體，凋亡受到抑制;bax大量表達(dá)時(shí)，則形成 bax同源二聚體，細(xì)胞趨向凋亡［8］。Lu等［9］研究大鼠閉合性腦損傷后中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元凋亡的時(shí)程，在4 h bax蛋白表達(dá)增高，并伴隨著bcl-2表達(dá)下調(diào)，在傷后l d處死的大鼠海馬區(qū)發(fā)現(xiàn)不同數(shù)量的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。彭申明等［10］研究顯示，雌激素和菟絲子總黃酮可抑制癡呆小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，可使抗凋亡蛋白bcl-2表達(dá)顯著升高，同時(shí)也明顯抑制癡呆小鼠促凋亡蛋白bax、caspase-3的表達(dá)，顯示其良好的抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用。

表1 6組大鼠海馬及下丘腦組織中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)(x ± s，n=8)

圖1 6組大鼠海馬區(qū)bcl-2蛋白的表達(dá)(PV×400)A組為正常對(duì)照組，僅給予等體積的生理鹽水;B組為模型組，給予等體積的生理鹽水;C、D、E組分別給予參姜鎖陽(yáng)益氣片70、140、280 mg/kg;F組給予大株紅景天膠囊280 mg/kg

圖2 6組大鼠海馬區(qū)bax蛋白的表達(dá)(PV×400)A組為正常對(duì)照組，僅給予等體積的生理鹽水;B組為模型組，給予等體積的生理鹽水;C、D、E組分別給予參姜鎖陽(yáng)益氣片70、140、280 mg/kg;F組給予大株紅景天膠囊280 mg/kg

圖3 6組大鼠海馬區(qū)caspase-3蛋白的表達(dá)(PV×400)A組為正常對(duì)照組，僅給予等體積的生理鹽水;B組為模型組，給予等體積的生理鹽水;C、D、E組分別給予參姜鎖陽(yáng)益氣片70、140、280 mg/kg;F組給予大株紅景天膠囊280 mg/kg

圖4 6組大鼠下丘腦bcl-2蛋白的表達(dá)(PV×400)A組為正常對(duì)照組，僅給予等體積的生理鹽水;B組為模型組，給予等體積的生理鹽水;C、D、E組分別給予參姜鎖陽(yáng)益氣片70、140、280 mg/kg;F組給予大株紅景天膠囊280 mg/kg

圖5 6組大鼠下丘腦bax蛋白的表達(dá)(PV×400)A組為正常對(duì)照組，僅給予等體積的生理鹽水;B組為模型組，給予等體積的生理鹽水;C、D、E組分別給予參姜鎖陽(yáng)益氣片70、140、280 mg/kg;F組給予大株紅景天膠囊280 mg/kg

圖6 6組大鼠下丘腦caspase-3蛋白的表達(dá)(PV×400)A組為正常對(duì)照組，僅給予等體積的生理鹽水;B組為模型組，給予等體積的生理鹽水;C、D、E組分別給予參姜鎖陽(yáng)益氣片70、140、280 mg/kg;F組給予大株紅景天膠囊280 mg/kg

caspase即半胱氨酞天冬氨酸特異性蛋白酶，是特異的凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，激活后的caspase是凋亡執(zhí)行者，caspase的超表達(dá)和激活均引起細(xì)胞凋亡，因此又稱“死亡蛋白酶”。caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶，其以不活躍的形式或酶原的形式存在于細(xì)胞中，其活性位點(diǎn)均含有半胱氨酸殘基，能夠特異性的切割靶蛋白天冬氨酸殘基后的肽鍵。酶原的氨基端有一段被稱為“原結(jié)構(gòu)域”的序列，酶原活化時(shí)將原結(jié)構(gòu)域切除，同時(shí)分成小片段(12kDa)和(17kDa)兩個(gè)亞型才能有效。其表達(dá)上調(diào)表明凋亡通路被激活，細(xì)胞死亡增加［11］。郁志華等［12］研究發(fā)現(xiàn)疲勞結(jié)合中、大劑量普萘洛爾在造成大鼠心氣虛證模型的基礎(chǔ)上，其腦內(nèi)皮層和海馬部位 bcl-2 mRNA表達(dá)明顯降低、海馬 caspase-3 mRNA表達(dá)明顯升高，說(shuō)明其腦內(nèi)皮層和海馬部位的神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。李巾偉等［13］研究顯示，三七總皂甙能促進(jìn)腦出血大鼠前腦內(nèi)抑凋亡基因bcl-2 mRNA的轉(zhuǎn)錄和bcl-2蛋白的表達(dá)，抑制促凋亡基因capase-3 mRNA的轉(zhuǎn)錄及capase-3蛋白的裂解活化，減少細(xì)胞凋亡。

本研究采用的參姜鎖陽(yáng)益氣片方中以西洋參、干姜、桂枝、白術(shù)為君藥，提高人體正氣，宣通血分，增強(qiáng)人體臟腑皮毛抗寒御寒能力;以麥冬、遠(yuǎn)志、補(bǔ)骨脂、淫羊藿、枸杞子、巴戟天為臣藥，益肺，補(bǔ)腎，強(qiáng)心，護(hù)腦，固護(hù)命門，提高血管壁的感受器和促心肌收縮物質(zhì)(兒茶酚胺)的功能、增強(qiáng)心腦排血量，使大動(dòng)脈至小動(dòng)脈毛細(xì)血管擴(kuò)張功能增強(qiáng)，提高人體整體抗御高寒能力，抗御寒邪直傷五臟;紅花、當(dāng)歸、阿膠、鎖陽(yáng)為佐藥，與人體臟腑皮毛之四末，抗寒，御寒，耐寒，增加人體毛細(xì)血管壁通透載體，提高囊泡飽吐功能，建立毛細(xì)血管前括約肌，真毛細(xì)血管網(wǎng)捷徑運(yùn)輸，使炅氣與滯血相通于脈中，致脈絡(luò)阻塞疏通至臟腑四末，使血之氣之諸迅速得以改善;以鹿茸、蓽拔為使藥，使上述信息速達(dá)于機(jī)體各處，快速改善由于高寒所造成的臟腑四末血滯，缺氧，功能減退，疲勞等癥候，達(dá)到陽(yáng)中益陰，以整體統(tǒng)局部，使君臣佐使諸藥融為一體，發(fā)揮其祛寒益氣之功效。

本研究結(jié)果表明，與A組比較，B組海馬區(qū)和下丘腦bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯降低，bax和capase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加，我們既往的研究顯示，寒凝氣滯血瘀癥大鼠抗氧化系統(tǒng)功能也明顯降低［14］。提示在寒冷應(yīng)激下，大鼠抗氧化清除自由基的功能減弱，導(dǎo)致血腦屏障通透性增加，腦組織水腫，從而引起神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡。與B組比較，C、D、E組海馬區(qū)和D、E組下丘腦bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞不同程度升高，而bax和capase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均有不同程度的降低。提示參姜鎖陽(yáng)益氣片可能通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡途徑而起到腦保護(hù)作用。

紅景天含有紅景天苷、酪醇、黃酮、多種微量元素、氨基酸、維生素A、C、D、E和超氧化物歧化酶等，具有益氣、活血、通脈等功效［15］。紅景天的免疫調(diào)節(jié)功效已被許多藥理實(shí)驗(yàn)所證實(shí)［16-17］。大株紅景天膠囊主要成分紅景天苷、紅景天素及莖葉提取物，具有活血化瘀，通脈止痛的功效。有文獻(xiàn)報(bào)道，紅景天制劑可以降低人體全血黏度、血漿黏度，減少血小板聚集，改善血液流變學(xué)及血脂情況，可降低人體氧耗量，提高氧利用率［17-19］。本研究結(jié)果顯示，與B組比較，F(xiàn)組海馬區(qū)和下丘腦bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞不同程度升高，而bax和capase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均有不同程度的降低，而C、D、E組海馬區(qū)bax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較F組升高，提示紅景天對(duì)寒冷刺激引起的微循環(huán)障礙，局部組織缺血缺氧具有較好的療效。

綜上所述，參姜鎖陽(yáng)益氣片可以影響腦組織中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，具有抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用，從而起到腦保護(hù)作用。

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