褐藻多糖硫酸酯在小鼠N2a細(xì)胞缺血再灌注損傷中的作用

李珊珊，徐志偉，桑文文，王偉英，楊 旭

缺血性腦卒中(ischaemic stroke，IS)是我國(guó)致殘和致死的主要疾病之一，目前雖然針對(duì)IS的治療方法有很多，但唯一有效的治療方法就是溶栓療法，患者受治療窗和禁忌證的限制使得溶栓的治療不能廣泛應(yīng)用。氧化應(yīng)激在IS中起重要作用，NF-E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)最近已被證明在生理?xiàng)l件下是調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的重要轉(zhuǎn)錄因子［1］。褐藻多糖硫酸酯(fucoidan，F(xiàn)PS)是一種天然來源的海藻多糖，具有多種生物活性，尤其是其抗炎和抗氧化活性近年來受到了學(xué)者的廣泛關(guān)注［2］。羅鼎真等［3］通過大鼠腦缺血再灌注損傷后腹腔內(nèi)注射FPS檢測(cè)大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和腦梗死的面積，發(fā)現(xiàn)FPS對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用，但是機(jī)制仍不明確。國(guó)內(nèi)外的研究表明，F(xiàn)PS可以抑制活性氧自由基的生成并促進(jìn)其清除，從而表現(xiàn)出抗氧化活性。我們前期的研究亦發(fā)現(xiàn)FPS對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用，能夠增加Nrf2的表達(dá)。故而我們?cè)诩?xì)胞離體水平上，建立小鼠 N2a細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧(OGD/R)模型，模擬腦缺氧缺血損傷的病理過程，觀察FPS對(duì)OGD/R引起N2a細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，并進(jìn)一步探討其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 鼠源性 β-actin抗體(Sigma:A1978)、蛋白酶抑制劑(Roche:4693132001)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/鼠二抗(Gibco，A16066，A16110);ECL發(fā)光試劑盒(Gibco，WP20005);BCA蛋白定量試劑盒(Thermo Scientific，23209);凋亡試劑盒CytoTox 96@非放射性細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(Promega，G1780);Bio-MaxMR X-線膠片(Kodak公司)。

1.2 N2a細(xì)胞及OGD/R模型制備 小鼠N2a成神經(jīng)瘤細(xì)胞(購(gòu)自協(xié)和細(xì)胞中心)，常規(guī)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM(含高葡萄糖，Gibco公司)完全培養(yǎng)基中，并置入37℃、含21%O2、5%CO2和74%N2常氧混合氣體、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h換液，2～3 d傳代。將N2a細(xì)胞分成對(duì)照組、OGD/R模型組、FPS處理組，其中OGD/R模型組細(xì)胞使用無糖Earle＇s平衡鹽溶液替換正常的細(xì)胞培養(yǎng)液，將其置于37℃含體積分?jǐn)?shù)0.95 N2和0.05 CO2的混合氣體的培養(yǎng)箱，2 h后換正常培養(yǎng)液，然后正常培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)24 h。對(duì)照組細(xì)胞使用有糖Earle＇s平衡鹽溶液正常條件培養(yǎng)2 h后，再換正常培養(yǎng)液正常條件繼續(xù)培養(yǎng)24 h。FPS處理組在造OGD/R模型前24 h 加入1、2、5、10 μg/ml的PFS 孵育。

1.3 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)測(cè)定 各組細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)要求處理后，每孔加入含0.5 g/L MTT細(xì)胞培養(yǎng)液150μl培養(yǎng)4 h。棄上清，每孔加 DMSO 150μl，37℃ 振搖孵育15 min，酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)檢測(cè)光密度值，來計(jì)算細(xì)胞生存率。此值越高代表N2a細(xì)胞存活率越高。

1.4 乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定 各組細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)要求處理后，收集各組培養(yǎng)液上清，然后使用體積分?jǐn)?shù)0.002 TritonX-100破膜，再次收集各組細(xì)胞液體，根據(jù)試劑盒說明書分別測(cè)得上清和細(xì)胞中的LDH活力，計(jì)算上清LDH/總LDH值，來確定細(xì)胞壞死水平。此值越高代表N2a細(xì)胞死亡率越高。

1.5 Western blot檢測(cè) 提取全細(xì)胞蛋白、BCA法定量，-80℃保存?zhèn)溆?。每組樣品取30μg蛋白進(jìn)行電泳(10%SDS-PAGE，4℃，20～30 mA)和轉(zhuǎn)膜(PVDF膜，300 mA，2 h)。先后用兔源性抗 HO-1(1∶1000)和鼠源性 β-actin(1∶1000)一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔/鼠二抗(1∶5000)進(jìn)行免疫雜交;然后用ECL發(fā)光，X線曝光、顯影、定影。所得結(jié)果用Gel Doc凝膠成像系統(tǒng)掃描后，對(duì)目的蛋白進(jìn)行定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 FPS對(duì)抗OGD/R誘導(dǎo)N2a細(xì)胞損傷的作用與對(duì)照組比較，MTT測(cè)定顯示OGD/R模型組和不同濃度FPS處理組N2a細(xì)胞存活率均顯著降低(P＜0.05，P ＜0.01)，當(dāng)FPS≤5 μg/ml時(shí)具有顯著性差異(P＜0.01);與OGD/R模型組比較，MTT結(jié)果顯示 FPS處理組N2a細(xì)胞存活率升高，F(xiàn)PS≥5μg/ml時(shí)具有顯著性差異(P＜0.01)，見表1。與對(duì)照組比較，LDH測(cè)定顯示OGD/R模型組和不同濃度FPS處理組N2a細(xì)胞死亡率均顯著升高(P＜0.05，P ＜0.01)，當(dāng) FPS≤5 μg/ml時(shí)具有顯著性差異(P＜0.01);與OGD/R模型組相比，LDH檢測(cè)結(jié)果顯示 FPS處理組N2a細(xì)胞死亡率降低，F(xiàn)PS=10.0μg/ml時(shí)具有顯著性差異(P＜0.01)，見表1。

表1 FPS對(duì)OGD/R小鼠N2a細(xì)胞存活率和死亡率的影響(x±s)

2.2 FPS增加Nrf2的核轉(zhuǎn)位 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，OGD/R模型組N2a細(xì)胞Nrf2的核轉(zhuǎn)位灰度值為1.20±0.10，較對(duì)照組增加(P＜0.05);其不同濃度(1、2、5、10 μg/ml)FPS均能促進(jìn) Nrf2的核轉(zhuǎn)移，其灰度值分別為1.63±0.21、2.30±0.20、2.80±0.10、2.90±0.26，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)，且在FPS≥2μg/ml時(shí)對(duì)Nrf2的核轉(zhuǎn)移促進(jìn)作用較明顯(P＜0.01);與OGD/R模型組相比，不同濃度FPS組Nrf2的核轉(zhuǎn)移均增加，F(xiàn)PS≥2μg/ml差異具有顯著意義(P ＜0.01)，見圖1。

2.3 FPS增加Nrf2下游蛋白血紅素加氧酶(HO-1)的表達(dá) Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，OGD/R模型組N2a細(xì)胞HO-1的表達(dá)量為1.13±0.12，但與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);不同濃度(1、2、5、10 μg/ml)FPS 組 HO-1 的表達(dá)分別為1.47 ±0.15、2.30 ±0.20、2.47 ±0.15、2.83 ±0.15，均較對(duì)照組增加(P＜0.05，P＜0.01)，當(dāng) FPS＞2μg/ml時(shí)差異具有顯著意義(P＜0.01)。與OGD/R模型組比較，F(xiàn)PS各濃度組HO-1的表達(dá)均增加(P ＜0.05，P＜0.01)，當(dāng) FPS＞2 μg/ml差異具有顯著意義(P＜0.01)，見圖2。

圖1 Western blot檢測(cè)FPS對(duì)OGD/R小鼠N2a細(xì)胞核轉(zhuǎn)位的影響 OGD/R:氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧;Nrf2:NF-E2相關(guān)因子2;Histon H3:內(nèi)參照

圖2 Western blot檢測(cè)FPS對(duì)OGD/R小鼠N2a細(xì)胞Nrf2下游蛋白HO-1表達(dá)的影響 OGD/R:氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧;Nrf2:NF-E2相關(guān)因子2;HO-1:血紅素加氧酶1

3 討論

N2a細(xì)胞是小鼠來源神經(jīng)瘤母細(xì)胞，是由R.J.Klebe和F.H.Ruddle經(jīng)A株白鼠的自生腫瘤建立，該細(xì)胞貼壁，已在多個(gè)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)并成功建立體外氧糖剝奪(OGD)模型［4-5］。OGD模擬體內(nèi)腦缺血過程是一個(gè)良好的并且經(jīng)典的模型［6-7］，氧化損傷增加的標(biāo)志物可以在這個(gè)模型中觀察到［8-9］。

氧化應(yīng)激是由于各種原因破壞了組織細(xì)胞的氧化和抗氧化平衡，致使ROS形成過多或者清除不足而形成的損傷狀態(tài)。ROS的產(chǎn)生可導(dǎo)致如生物膜結(jié)構(gòu)和功能的改變、損傷DNA導(dǎo)致細(xì)胞突變等一系列有害作用。因此，保持體內(nèi)ROS的平衡對(duì)維持正常過程至關(guān)重要。近年來，多項(xiàng)研究提示，多糖具有提高抗氧化酶活性、清除自由基等作用，在保護(hù)生物膜中發(fā)揮著重要作用。其中，F(xiàn)PS作為一種具有生物活性的硫酸化多糖，主要存在于藻類和棘皮動(dòng)物中，具有顯著的體外抗氧化活性，對(duì)-OH、O2-具有良好的清除作用，可降低血清中過氧化脂質(zhì)含量，同時(shí)顯著提高組織中超氧化物歧化酶的含量。范瑩等［10］研究表明Fu可以降低大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分，縮小大腦梗死體積;并在SH-SY5Y細(xì)胞上驗(yàn)證了Fu可以減輕缺糖缺氧對(duì)細(xì)胞的毒性作用，并降低細(xì)胞的凋亡率，但是其機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在N2a細(xì)胞OGD/R模型中應(yīng)用FPS可顯著提高細(xì)胞存活率，并呈濃度依賴性。本研究亦發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)PS也可濃度依賴性抑制OGD/R誘導(dǎo)LDH的釋放。結(jié)果提示，F(xiàn)PS可以增強(qiáng)細(xì)胞的活力、減少細(xì)胞的凋亡，減輕OGD/R對(duì)細(xì)胞的損傷。

Nrf2是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子。在正常情況下，Nrf2在細(xì)胞質(zhì)與Keap1蛋白結(jié)合處于非活性狀態(tài)。氧化應(yīng)激時(shí)，Nrf2與Keap1解離，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，啟動(dòng)下游靶基因HO-1和其他抗氧化酶如NAD(P)H醌氧化還原酶(NQO1)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)及谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)等［11-13］，從而發(fā)揮抗氧化作用［14］;這些作用已經(jīng)在腦缺血損傷中證實(shí)過［15-18］。既往研究表明，激活Nrf2信號(hào)通路繼而上調(diào)其下游靶蛋白的表達(dá)，可以對(duì)缺血性腦卒中起到保護(hù)作用。Tanaka等［19］的研究發(fā)現(xiàn)，MCAO 后再灌注，2 h后Nrf2表達(dá)增加并在8 h達(dá)到高峰;其下游抗氧化蛋白Trxs、GSH以及HO-1在24～72 h梗死區(qū)域的表達(dá)亦顯著升高。大鼠MCAO模型中，側(cè)腦室或腹腔內(nèi)注射tBHQ均可降低運(yùn)動(dòng)感覺缺損和缺血后的梗死面積［20-21］。與此項(xiàng)研究類似，Nrf2敲除小鼠MCAO后90 min進(jìn)行再灌注，其神經(jīng)功能缺損惡化并伴有梗死面積增加［22］。此外，Nrf2基因敲除小鼠的pMCAO模型中，其損傷后7 d的恢復(fù)情況亦顯著降低［20］。故活化Nrf2信號(hào)通路對(duì)缺血性腦卒中后的損傷具有保護(hù)作用。在本研究中，我們應(yīng)用Western blot法檢測(cè)了各組細(xì)胞胞漿和胞核內(nèi)Nrf2的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)N2a細(xì)胞OGD/R后Nrf2及其下游靶蛋白HO-1表達(dá)均增加，提示氧化損傷后可以激活Nrf2/ARE通路，起到自身抗氧化作用;同時(shí)發(fā)現(xiàn)FPS能夠有效促進(jìn)Nrf2的核轉(zhuǎn)位，并呈劑量依賴性。因此推測(cè)，F(xiàn)PS對(duì)腦缺血再灌注的保護(hù)作用可能是通過促進(jìn)Nrf2的表達(dá)，降低了腦缺血再灌注時(shí)氧化應(yīng)激的水平。

Nrf2/ARE信號(hào)通路可誘導(dǎo)Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶類等多種抗氧化物質(zhì)的生成。HO-1作為重要的Ⅱ相解毒酶，其通過催化血紅素轉(zhuǎn)化為等分子量的膽綠素、一氧化碳和游離鐵發(fā)揮著強(qiáng)大的抗氧化作用，是反映細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果提示，不同濃度FPS處理能夠促進(jìn)HO-1的表達(dá)，這亦間接提示Nrf2在腦缺血再灌注中發(fā)揮著抗氧化應(yīng)激作用。

綜上所述，F(xiàn)PS對(duì)OGD/R的N2a細(xì)胞有劑量依賴性的抗氧化應(yīng)激作用，其保護(hù)機(jī)制可能部分是通過促進(jìn)Nrf2的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)，但其更加詳細(xì)的抗氧化應(yīng)激機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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