津力達(dá)對高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠血清瘦素、脂聯(lián)素的影響

段力園，趙 靜，劉頤軒，宋光耀

胰島素抵抗(IR)是2型糖尿病以及多種代謝性疾病如肥胖、代謝綜合征的共同病理生理基礎(chǔ)，脂肪源性細(xì)胞因子分泌的異常與IR的形成和發(fā)展密切相關(guān)［1-3］。研究顯示，多種單味中藥，如黃連、人參、黃芪等可以改善IR［4-8］。津力達(dá)是由17味中藥所組成的中藥復(fù)方制劑，臨床試驗(yàn)證實(shí)其可有效降低血糖，改善2型糖尿病患者的癥狀。既往研究表明，津力達(dá)可保護(hù)胰島β細(xì)胞，增加胰島素分泌，改善IR［9-11］，但其作用機(jī)制尚不明確。我們擬通過本研究，觀察津力達(dá)對IR大鼠脂肪源性細(xì)胞因子分泌的影響，探討其改善IR的部分機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及模型制備 雄性SD大鼠36只，體重125～145 g，購于中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動物資源研究所［合格證號:slxk(京)7009-0017］。飼養(yǎng)條件為:每籠2只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后稱重，隨機(jī)分為正常對照組12只和高脂飲食組24只。正常對照組給予正?；A(chǔ)飼料(總熱量為348 kcal/100 g，碳水化合物占 65.5%、脂肪占10.3%、蛋白質(zhì)占24.2%)，高脂飲食組給予高脂飼料(總熱量為501 kcal/100 g，碳水化合物占20.1%、脂肪占59.8%、蛋白質(zhì)占20.1%)，所有飼料購于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。兩組分別喂養(yǎng)6周后，每組隨機(jī)選取6只行高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗(yàn)，判斷造模是否成功。

1.2 高胰島素－正葡萄糖鉗夾試驗(yàn) 參考Kraegen等［12］于1983年建立的高胰島素-正葡萄糖鉗夾技術(shù)，具體操作步驟:隨機(jī)選取6只大鼠禁食12 h，過夜后于次晨稱重，空腹?fàn)顟B(tài)下以3%戊巴比妥鈉(北京Solarbio公司)行腹腔注射麻醉，劑量為40 mg/kg。在麻醉狀態(tài)下，于大鼠頸前右側(cè)斜行剪開長1.5 cm切口，行右側(cè)頸動、靜脈插管，插入長度為2.0～2.5 cm，導(dǎo)管經(jīng)皮下從頸后引出，用肝素(100 U/ml)抗凝封管，最后將導(dǎo)管結(jié)扎固定于頸后皮膚。大鼠清醒后單籠飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，并注意保暖、抗感染。4～5 d后，大鼠應(yīng)激狀態(tài)消失，表現(xiàn)為體重恢復(fù)至插管前水平，再次禁食12 h，過夜，第2天清晨在清醒狀態(tài)下行高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗(yàn)。頸動脈導(dǎo)管連接裝有肝素生理鹽水的注射器，濃度為50 U/ml;頸靜脈導(dǎo)管通過三通管連接雙通道微量注射泵(浙江醫(yī)科大學(xué)，WZS-50F)，一端連接濃度為40 mU/ml胰島素注射液(江蘇萬邦公司)，另一端連接30%葡萄糖注射液。先用血糖儀(美國羅氏，Advantage)測定大鼠基礎(chǔ)血糖，然后以4 mU/(kg·min)的恒定速率輸注胰島素溶液，每間隔5 min測定1次血糖;當(dāng)血糖降至低于基礎(chǔ)值時，開始以9～14 mg/(kg·min)的速度輸注30%的葡萄糖注射液，隨后每間隔10 min測定大鼠血糖1次，根據(jù)血糖水平調(diào)整葡萄糖注射液的輸注速率，使大鼠血糖穩(wěn)定在(5.0±0.5)mmol/L。當(dāng)血糖穩(wěn)定后，每隔5 min測定1次血糖，記錄連續(xù)6次血糖的平均值，計(jì)算葡萄糖輸注率(GIR)。GIR=血糖穩(wěn)定時葡萄糖輸注速率×葡萄糖濃度/體重(g)/60，此結(jié)果即為評價(jià)大鼠胰島素敏感性的指標(biāo)。

1.3 藥物干預(yù) 高胰島素－正葡萄糖鉗夾試驗(yàn)確定IR大鼠模型造模成功后，將高脂飲食組剩余18只大鼠隨機(jī)分為高脂飲食對照組、津力達(dá)組和二甲雙胍組，每組6只。津力達(dá)組給予津力達(dá)(石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司)超微粉末生理鹽水混懸液3.0 g/(kg·d)灌胃;二甲雙胍組給予二甲雙胍(中美上海施貴寶制藥有限公司，批號:1401080)粉末生理鹽水混懸液0.2 g/(kg·d)灌胃;正常對照組和高脂飲食組給予與二甲雙胍組等量生理鹽水灌胃，每天9:00灌胃1次，持續(xù)8周。正常對照組繼續(xù)給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，其余各組繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)，藥物干預(yù)期間飼養(yǎng)條件不變，根據(jù)體重調(diào)整給藥量。

1.4 大鼠血清指標(biāo)的測定 藥物干預(yù)8周后，大鼠禁食12 h過夜，次晨稱重并用3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，并在麻醉狀態(tài)下開腹，選取腹主動脈取血，所采血標(biāo)本中加入總體積1%的肝素抗凝劑，收集后室溫(20～50℃)靜置30 min，低溫離心機(jī)(德國Hettich公司，EBA12R)3000 r/min離心15 min，取上清，-80℃低溫冰箱(青島海爾特種電器有限公司，DW86L486)分裝保存以備使用。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(上海藍(lán)基生物科技有限公司)測定瘦素、胰島素、脂聯(lián)素、抵抗素、游離脂肪酸(FFA)，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。具體操作步驟:取出 ELISA試劑盒，于室溫(20～50℃)放置30 min;取出酶標(biāo)板，按照標(biāo)準(zhǔn)品的次序分別加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于空白微孔中;空白孔中加入50μl樣品，空白對照孔加入50μl PBS(pH 7.0～7.2);在各孔中加入100μl的酶標(biāo)記溶液(不含空白對照孔);將酶標(biāo)板用封口膠密封后，37℃孵育箱(上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠，101A-2)孵育反應(yīng)1 h;用試劑盒中提供的清洗液(濃縮洗滌液以1∶100的比例與蒸餾水稀釋)充分清洗酶標(biāo)板5次，保持各孔有充足的水壓;酶標(biāo)板洗滌后用吸水紙徹底拍干;各孔加入顯色劑A和B各50μl;37℃下避光反應(yīng)10～15 min;各孔加入50μl終止液，終止反應(yīng);用酶標(biāo)儀(芬蘭，Multiskan Mk3)于560 nm處測定吸光率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 GIR 喂養(yǎng)6周后高脂飲食組GIR為(14.9±0.82)mg/(kg·min)明顯低于正常對照組(26.5±0.78)mg/(kg·min)(P＜0.05)。提示高脂飲食組大鼠出現(xiàn)明顯的IR［13］，高脂飼料喂養(yǎng)成功建立了IR大鼠模型。藥物干預(yù)8周后，GIR正常對照組為(27.1±0.89)mg/(kg·min)，高脂飲食對照組為(15.5±0.69)mg/(kg·min)，津力達(dá)組為(23.9 ±0.81)mg/(kg·min)，二甲雙胍組為(24.3±0.69)mg/(kg·min)。高脂飲食對照組GIR較正常對照組降低，津力達(dá)組及二甲雙胍組GIR較高脂飲食對照組升高(P＜0.05)，但兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 血清指標(biāo) 藥物干預(yù)8周后，高脂飲食對照組血清瘦素、胰島素、抵抗素、FFA較正常對照組升高，脂聯(lián)素水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與高脂飲食對照組比較，津力達(dá)組和二甲雙胍組血清瘦素、胰島素、抵抗素、FFA水平均降低，血清脂聯(lián)素水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 藥物干預(yù)8周后4組大鼠血清瘦素、胰島素、脂聯(lián)素、抵抗素、游離脂肪酸的變化(x±s)

3 討論

近年來，由于人們生活水平的提高和不健康的飲食方式，高脂血癥的發(fā)病率逐年升高。高脂血癥是促使IR、動脈粥樣硬化、冠心病等疾病發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素［13］。這些疾病可以造成人體多種靶器官的損害，嚴(yán)重降低了患者生活質(zhì)量，縮短了患者的預(yù)期壽命。據(jù)報(bào)道，我國≥18歲居民血脂異常率高達(dá)18.6%［14］。目前高脂血癥尚無統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)。一般來講，血漿總膽固醇濃度＞5.72 mmol/L即可定為高膽固醇血癥，血漿甘油三酯濃度 ＞1.70 mmol/L為高甘油三酯血癥。臨床主要應(yīng)用的降脂類藥物有他汀類、煙酸及其衍生物、貝特類等藥物，而調(diào)整飲食習(xí)慣及增加體育活動、控制體重等生活方式的改變是預(yù)防和治療血脂異常的關(guān)鍵。

研究表明，脂肪組織不僅是能量儲備器官，還是一個代謝活躍、功能復(fù)雜的內(nèi)分泌器官［15］。脂肪組織可以分泌許多與糖和脂肪代謝相關(guān)的脂肪因子，通過這些因子廣泛地影響和調(diào)節(jié)機(jī)體的能量代謝及各種功能［16］，其中瘦素、胰島素、脂聯(lián)素、抵抗素和FFA在IR的形成和發(fā)展中起著重要作用。

瘦素主要由白色脂肪組織產(chǎn)生，可以引起食欲缺乏和機(jī)體能量消耗增加從而使體重減輕，有觀點(diǎn)認(rèn)為，瘦素是IR發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［17］。在肥胖以及IR狀態(tài)下，往往表現(xiàn)為瘦素抵抗，即高瘦素血癥，但因其與受體結(jié)合障礙或者受體表達(dá)下調(diào)，血清瘦素不能發(fā)揮生理作用，從而產(chǎn)生瘦素抵抗［18］。本實(shí)驗(yàn)中，高脂飲食對照組中血清瘦素、胰島素水平升高，表明高瘦素血癥使“脂肪-胰島素軸”反饋機(jī)制破壞，導(dǎo)致高胰島素血癥或IR，或?qū)⑦M(jìn)一步導(dǎo)致肝內(nèi)脂肪蓄積。津力達(dá)和二甲雙胍均能降低血清瘦素以及胰島素水平，減輕高瘦素血癥以及IR。

脂聯(lián)素是由脂肪組織分泌的唯一發(fā)揮保護(hù)作用的脂肪細(xì)胞因子，在體內(nèi)的生理作用主要是增加胰島素敏感性，促進(jìn)脂肪代謝，增加能量消耗，抑制內(nèi)源性葡萄糖生成從而使IR減輕［19］。而在肥胖以及IR患者血中脂聯(lián)素濃度明顯下降，導(dǎo)致胰島素敏感性下降、血壓升高、動脈粥樣硬化等。本實(shí)驗(yàn)中津力達(dá)和二甲雙胍干預(yù)后均不同程度地增加了血清脂聯(lián)素水平，可能在一定程度抑制了動脈粥樣硬化發(fā)生。

抵抗素存在于血漿中，是脂肪細(xì)胞分泌的富含半胱氨酸的多肽類激素［20］，國內(nèi)外研究的焦點(diǎn)主要為其與肥胖、糖尿病之間的關(guān)系。抵抗素可能是肥胖和IR之間的重要鏈接，2型糖尿病的發(fā)生可能與抵抗素表達(dá)水平增高有關(guān)［21］。已有研究表明，抵抗素在人胰島中有表達(dá)［22］，抵抗素可以作用于胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致IR。但有關(guān)抵抗素對胰島分泌功能的研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中津力達(dá)和二甲雙胍均能降低抵抗素水平，減輕IR。

FFA升高可以增加肝臟內(nèi)源性葡萄糖生成，減少組織對葡萄糖的攝?。?3］，導(dǎo)致空腹血糖升高及高胰島素血癥，F(xiàn)FA在組織和血液中含量增加可以導(dǎo)致IR的形成，并在IR的發(fā)展中起著負(fù)面的作用。

本研究證明，高脂飲食成功誘導(dǎo)了IR大鼠模型，同時瘦素、胰島素、抵抗素和FFA含量升高，脂聯(lián)素濃度降低。說明高脂飲食使大鼠脂肪分解增加，F(xiàn)FA含量升高，干擾胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響了糖脂代謝;同時，對糖脂代謝有正面調(diào)節(jié)作用的脂聯(lián)素水平下降，從另一方面影響了胰島素敏感性，最終導(dǎo)致IR。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，津力達(dá)和二甲雙胍均能使高脂飲食對照組脂肪細(xì)胞因子的分泌趨于正常，間接證實(shí)了脂肪細(xì)胞因子分泌失調(diào)與IR的發(fā)生密切相關(guān);并且，中成藥津力達(dá)的功效接近于二甲雙胍，能夠明顯降低瘦素、抵抗素和FFA水平，提高脂聯(lián)素水平，這可能是其改善IR的部分作用機(jī)制。

目前臨床治療IR主要應(yīng)用雙胍類、格列酮類、降脂類藥物等。然而，這些藥物引起的不良反應(yīng)，如乳酸性酸中毒、肝腎損害、肌肉疼痛等，導(dǎo)致部分患者不能耐受，從而不能夠長期堅(jiān)持服用。我國傳統(tǒng)的中醫(yī)中藥在治療高脂血癥、IR等慢性疾病方面有著巨大的優(yōu)勢和潛力。動物實(shí)驗(yàn)顯示津力達(dá)與目前廣泛應(yīng)用的治療藥物療效相當(dāng)。當(dāng)然，其療效及不良反應(yīng)還需臨床試驗(yàn)的進(jìn)一步證實(shí)。

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