褐藻多糖硫酸酯對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)保護(hù)作用

李珊珊，徐志偉，桑文文，王偉英，楊 旭

缺血性腦卒中是人類致殘、致死的主要原因之一。其病理生理學(xué)機(jī)制涉及鈣超載、興奮性毒性、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及線粒體功能障礙等［1-2］。在腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury，I/R)中，活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生極大地導(dǎo)致氧化應(yīng)激，促進(jìn)脂質(zhì)、糖、蛋白質(zhì)和DNA的損傷。可以認(rèn)為氧化應(yīng)激在I/R過(guò)程中起著主要作用。褐藻多糖硫酸酯(fucoidan，F(xiàn)PS)是一種天然來(lái)源的海藻多糖，具有多種生物活性。在體外和體內(nèi)的各種研究表明，F(xiàn)PS具有很強(qiáng)的抗氧化性能［3-5］。此外，研究同時(shí)表明 FPS對(duì)草酸鹽引起的大鼠腎臟過(guò)氧化損傷具有保護(hù)作用［6］，這也證實(shí)FPS可能對(duì)I/R損傷的保護(hù)作用。Geng等研究表明FPS可以降低大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分、縮小大腦梗死體積［7］;然而，F(xiàn)PS對(duì)腦缺血損傷的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制尚不完全清楚。轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)信號(hào)通路在細(xì)胞抗氧化反應(yīng)中發(fā)揮中樞調(diào)控作用［8］。因此可提出一個(gè)假設(shè)，即FPS對(duì)于局灶性腦缺血具有神經(jīng)保護(hù)作用，其保護(hù)作用至少有一部分與Nrf2/ARE信號(hào)通路的激活改善氧化應(yīng)激有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠48只(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，體重220～260 g;鼠源性 -actin抗體(Sigma:A1978)、蛋白酶抑制劑(Roche:4693132001)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/鼠二抗(Gibco，A16066，A16110)，F(xiàn)PS(Sigma，F(xiàn)5631)，Nrf2(Abcam，ab62352)，Bio-Max-MR X線膠片(Kodak公司)，Image Quant LAS 4000凝膠成像系統(tǒng)(GE healthcare)。戊巴比妥鈉(北京普博斯生物，P3761)，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，Sigma，T8877)，MCAO 線栓(北京沙東生物技術(shù)有限公司，2432)。

1.2 動(dòng)物分組 將48只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為假手術(shù)組、大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)組、FPS低劑量組(MCAO+FPS 50 mg/kg)、FPS高劑量組(MCAO+FPS100 mg/kg)，每組12只。

1.3 大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型制備 大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型采用Longa［9］改良線栓法制備，缺血2 h后拔出尼龍線栓，血流再通。假手術(shù)組大鼠只分離右側(cè)頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)外動(dòng)脈。術(shù)后按照Longa標(biāo)準(zhǔn)［9］進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分:0分為正常，無(wú)神經(jīng)學(xué)征象;1分為動(dòng)物不能完全伸展左前肢;2分為動(dòng)物左側(cè)肢體癱瘓，行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈，出現(xiàn)追尾現(xiàn)象;3分為動(dòng)物行走向左側(cè)跌倒，或動(dòng)物不能站立或動(dòng)物打滾:4分為無(wú)自發(fā)活動(dòng)，有意識(shí)障礙。神經(jīng)功能評(píng)分在1～3分為模型建立成功，0分和4分大鼠均予以剔除。

1.4 給藥方法 FPS低、高劑量組大鼠在造模成功2 h再灌注后立即予尾靜脈分別注射FPS溶液50、100 mg/kg，連續(xù)給藥 3 d。

1.5 觀察項(xiàng)目

1.5.1 大鼠行為學(xué)表現(xiàn):FPS溶液干預(yù)后第3天，取各組大鼠8只進(jìn)行Longa評(píng)分，比較大鼠行為學(xué)表現(xiàn)。

1.5.2 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(triphe-nyltetrazolium chloride，TTC)法測(cè)定腦梗死體積:各組分別取8只大鼠快速斷頭取前腦，置 －20℃冰箱冷凍10 min，剔除嗅腦、低位腦干及小腦，冠狀位將其按2 mm厚度冠狀切成6片，浸于37℃ 2 g/L 2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸緩沖溶液中避光溫浴染色30 min，在鏡下觀察計(jì)算梗死面積，按Swanson間接法［10］計(jì)算出腦梗死體積，腦梗死體積(mm3)=各層梗死面積之和×層間隔。所有腦組織切片正常組織染成深紅色，而梗死灶顯示白色。利用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行處理，計(jì)算出梗死體積。

1.5.3 蛋白印跡(Western-blot)法測(cè)定Nrf2的表達(dá):各組分別取3只大鼠提取全細(xì)胞蛋白3組，BcA法定量，－80℃保存?zhèn)溆?。每組樣品取50μg蛋白進(jìn)行電泳(10%SDS-PAGE，4℃，20 ～30 mA)和轉(zhuǎn)膜(PVDF膜，300 mA，2 h)。鼠源性-actin(1∶1000)一抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔/鼠二抗(1∶5000)進(jìn)行免疫雜交;然后用電化發(fā)光，X線膠片曝光、顯影、定影。所得結(jié)果用Image Quant LAS 4000凝膠成像系統(tǒng)掃描后，對(duì)目的蛋白進(jìn)行定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS l3．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 FPS對(duì)I/R大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響 與MCAO組比較，F(xiàn)PS低、高劑量組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分均降低，F(xiàn)PS高劑量組降低得更為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，P ＜0.01)，見(jiàn)表1。

2.2 FPS對(duì)I/R大鼠腦梗死體積的影響 FPS低劑量組與MCAO組大鼠腦梗死體積無(wú)明顯差異，F(xiàn)PS高劑量組大鼠的腦梗死體積明顯小于MCAO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)表1、圖1。

2.3 FPS對(duì)I/R大鼠Nrf2表達(dá)的影響 假手術(shù)組、MCAO組、FPS低劑量組、FPS高劑量組Nrf2蛋白表達(dá)量分別為 0、2．20 ± 0．26、2．93 ± 0．15、4．30 ±0.36，與MCAO組比較，F(xiàn)PS低、高劑量組大鼠Nrf2明顯升高，F(xiàn)PS高劑量組升高得更為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，P ＜0.01)，見(jiàn)圖2。

表1 4組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及腦梗死體積比較(x±s)

圖1 褐藻多糖硫酸酯對(duì)缺血再灌損傷大鼠腦梗死體積的影響M1～6．為大腦連續(xù)冠狀切片;紅色為正常組織，白色為未被染色的梗死組織

3 討論

大鼠MCAO誘導(dǎo)腦缺血模型是一個(gè)經(jīng)典的模型［9-11］，氧化損傷增加的標(biāo)志物可以在這個(gè)模型中觀察到［12-16］。在腦缺血發(fā)作的最初幾分鐘就可以觀察到細(xì)胞的毒性發(fā)應(yīng)，包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞死亡和神經(jīng)系統(tǒng)的損害［12-13，15］。故而這一模型可以用于研究I/R中FPS的作用。

圖2 FPS對(duì)局灶性腦缺血大鼠Nrf2蛋白表達(dá)的影響MCAO．大腦中動(dòng)脈栓塞，F(xiàn)PS．褐藻多糖硫酸酯;Nrf2．轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2;β-actin．內(nèi)參照

本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)PS預(yù)處理可顯著改善I/R大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及減少梗死體積，表明FPS對(duì)I/R損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用，與羅鼎真等［16］報(bào)道一致;同時(shí)本研究觀察到FPS預(yù)處理后Nrf2的表達(dá)增加。最新研究表明，Nrf2是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的保護(hù)因子并且是抗氧化反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)器［14，17-18］。在正常情況下Nrf2定位于細(xì)胞質(zhì)中，與Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)蛋白結(jié)合而使其活性受到抑制并且被不斷降解［19］。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激或者Ⅱ相酶誘導(dǎo)劑存在時(shí)，Nrf2磷酸化，從Keap1蛋白上解離出來(lái)，進(jìn)行核轉(zhuǎn)位。磷酸化的Nrf2進(jìn)入到細(xì)胞核后，與ARE結(jié)合激活啟動(dòng)下游血紅素加氧酶-1(HO-1)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)和醌氧化還原酶-1(NQO1)，以 減 輕 細(xì) 胞 氧 化 應(yīng) 激［20-21］。Tanaka等［22-23］研究發(fā)現(xiàn)，大鼠MCAO再灌注2 h后Nrf2表達(dá)增加并在8 h達(dá)到高峰，其下游抗氧化蛋白谷胱甘肽(glutathione，GSH)以及HO-1 24～72 h在梗死區(qū)域的表達(dá)亦顯著升高。大鼠MCAO模型中，側(cè)腦室或者腹腔內(nèi)注射Nrf2激動(dòng)劑叔丁基對(duì)苯二酚(Tertiary butylhydroquinone，tBHQ)均可以降低運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)功能和缺血后的梗死面積［24］。而活化Nrf2通路可以清除ROS，對(duì)IS損傷后具有神經(jīng)保護(hù)作用。Nrf2-/-小鼠腦損傷后可以產(chǎn)生更多的ROS［25］。在I/R組，氧化應(yīng)激產(chǎn)生大量的ROS，同時(shí)腦中抗氧化酶的缺乏，可以導(dǎo)致腦內(nèi)脂質(zhì)、糖、蛋白質(zhì)及DNA的損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡及腦功能障礙。為了保護(hù)腦組織不受ROS的破壞，啟動(dòng)包括超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽還原酶(GSH)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)等。既往研究表明，F(xiàn)PS具有明顯的抗氧化活性。Wang等在體外對(duì)3種海藻多糖的抗氧化活性進(jìn)行了對(duì)比性研究，發(fā)現(xiàn)海帶Fu具有一定的清除-OH、O2－的活性，并能螯合Fe2+［4］。陸艷娟等［26］發(fā)現(xiàn) FPS 能夠提高老年小鼠SOD、GSH-Px活力，降低丙二醛(MDA)含量，具有一定清除自由基的作用，其特有的組分為有效清除自由基、提高抗氧化酶活性提供了重要基礎(chǔ)。李兆杰等［27］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)PS能顯著降低高脂血癥大鼠血清中過(guò)氧化脂質(zhì)含量，同時(shí)顯著升高血清和肝、腦等組織中SOD的含量。從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，F(xiàn)PS能夠通過(guò)清除自由基、提高抗氧化酶活性以保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷。

綜上所述，本研究結(jié)果連同既往研究表明，Nrf2信號(hào)通路在FPS對(duì)I/R的神經(jīng)保護(hù)中發(fā)揮作用。為了深入探討FPS通過(guò)Nrf2信號(hào)通路作用的分子機(jī)制，可進(jìn)一步完善 Nrf2下游靶基因 HO-1、ROS、MDA及GSH的表達(dá)狀況的研究。FPS可能成為治療缺血性腦卒中的新型藥物，而Nrf2信號(hào)通路則可能成為其治療的新靶點(diǎn)。

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