不同模式間歇低氧對大鼠血糖、血清胰島素及胰腺組織Caspase-3活性及其表達(dá)的影響

王東亮，盧 巍，劉練達(dá)，林雪嬌，康 健

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(obstructive sleep apnea syndrome，OSAS)是臨床常見的綜合征，OSAS患者中2型糖尿病發(fā)病率明顯高于非OSAS患者，且獨立于肥胖及年齡因素［1］。間歇低氧為OSAS的特征性低氧方式，胰島素抵抗和胰島細(xì)胞功能障礙為2型糖尿病的兩個主要病理生理機制，研究證明，間歇低氧誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激可以引起胰島素抵抗，而胰島細(xì)胞為全身對氧化應(yīng)激最敏感的細(xì)胞之一［2］。有學(xué)者證實了間歇低氧可以誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡［3-4］，由此可見間歇低氧在糖代謝異常中起到了重要的作用。既往臨床多依據(jù)呼吸暫停低通氣指數(shù)(apnea hypopnea index，AHI)作為判定病情嚴(yán)重程度的標(biāo)準(zhǔn)，然而臨床對OSAS患者進(jìn)行多導(dǎo)睡眠儀監(jiān)測時發(fā)現(xiàn)，有的患者每次呼吸暫停持續(xù)時間長，血氧飽和度下降幅度大，AHI并不高，這部分患者往往被列入輕度病情的行列;另有一部分患者睡眠呼吸暫停發(fā)作頻繁，血氧飽和度波動幅度小，AHI非常高，被列入中、重度病情的行列;而前者并發(fā)癥出現(xiàn)早，病情程度重，這樣會造成臨床醫(yī)師對患者疾病嚴(yán)重程度評估不準(zhǔn)確，延誤治療或造成醫(yī)療資源浪費。

本研究主要以間歇低氧大鼠模擬人體睡眠呼吸暫停狀態(tài)，以胰腺組織為切入點，選取經(jīng)典的凋亡因子Caspase-3作為檢測指標(biāo)，研究不同模式的間歇低氧對胰腺組織的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 63只雄性SD清潔級大鼠(中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)，鼠齡8～12周，體重150～200 g，隨機分為常氧對照組、間歇低氧1組(高頻輕度)、間歇低氧2組(低頻重度)，每組隨機分為暴露1、2、4周組，每組7只。

1.2 儀器和試劑 間歇低氧艙(Oxycycler Model A84XO，BioSpherix Instruments，USA)，血 糖 儀(ROCHE);Trizol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA);焦磷酸二乙酯(Diethypyrocarbonate DEPC，Sigma);非凍型組織RNA保存液(北京天恩澤基因科技有限公司);PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser(Takara DRR047);SYBR Premix Ex TaqⅡ(Takara DRR081);抗大鼠Caspase-3一抗(Cell Signalling);二抗(北京博奧森生物工程公司);鏈霉親和素－生物素系統(tǒng)(strept avidin biotin complex，SABC)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，大鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒，大鼠Caspase-3活性ELISA試劑盒。

1.3 實驗方法 常氧對照組于空氣條件下飼養(yǎng)，余各組于間歇低氧設(shè)備內(nèi)暴露8 h/d。其中間歇低氧1組低氧方案為:10%氧30 s，21%氧62 s，每周期耗時170 s，21次/h，8 h/d;間歇低氧2組低氧方案為:5%氧 15 s，21% 氧 142 s，每周期耗時 360 s，10/h，8 h/d。由于間歇低氧艙內(nèi)設(shè)有氧電極，可以實時檢測艙內(nèi)的氧濃度，反饋給計算機，調(diào)整充入氮氣的速度，為避免過快充入氮氣引起氧濃度下降過快，越接近設(shè)定的濃度越進(jìn)行微調(diào)，這就導(dǎo)致了由21%氧下降至所設(shè)定的氧濃度(5%、10%)最初的速度較快，表現(xiàn)為曲線陡直，到接近設(shè)定濃度時下降緩慢，這是機器本身性能所決定的，不能完全模擬人類的突然呼吸暫停、突然覺醒的模式，因此本研究追求的不是單純意義上的氧濃度，而是以此濃度為最低點的深慢和淺快的間歇低氧模式。兩組氧濃度－時間變化曲線見圖1、2。

圖1 間歇低氧1組氧濃度－時間變化曲線

圖2 間歇低氧2組氧濃度－時間變化曲線

1.4 檢測指標(biāo) 為動態(tài)觀察個體血糖隨時間變化，選取暴露 4周組大鼠于 0、1、2、4周采尾血以ROCHE血糖儀檢測空腹血糖。各組大鼠分別于暴露1、2、4周空腹8 h后麻醉摘眼球取血，血樣本用KDC－40低速離心機3000 r/min離心15 min，離取血清，－80℃凍存，采用大鼠胰島素ELISA試劑盒測定血清胰島素水平。取胰腺組織－80℃凍存，組織勻漿以大鼠Caspase-3活性ELISA試劑盒定量檢測Capase-3活性;實時熒光定量PCR法檢測胰腺組織Capase-3 mRNA水平;免疫組化SABC法定性檢測胰腺Capase-3蛋白表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用單因素方差分析，α=0．05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 血糖 3組0周及常氧對照組暴露4周組0、1、2、4周血糖水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。間歇低氧1組暴露4周組暴露1周與0周比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，暴露2、4周血糖高于0周和常氧對照組暴露4周組2、4周(P＜0.05，P＜0.01)，暴露2、4周與暴露1周比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，暴露4周與2周比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。間歇低氧2組暴露4周組隨暴露時間延長血糖增高，暴露1、2、4周與0周比較血糖明顯增高(P＜0.01)，且暴露2、4周均高于暴露1周，暴露4周高于2周(P＜0.05);暴露1周血糖高于常氧對照組、間歇低氧1組暴露4周組(P＜0.01);暴露2周血糖水平高于常氧對照組暴露4周組(P＜0.01)，與間歇低氧1組暴露4周組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05);暴露4周間歇低氧2組暴露4周組血糖較常氧對照組暴露4周組、間歇低氧1組暴露4周組血糖明顯增高(P＜0.01，P ＜0.05)。見表1。

表1 3組大鼠不同暴露時間血糖值比較(x ± s，mmol/L)

2.2 血清胰島素、胰腺組織 Caspase-3活性、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平 常氧對照組暴露1、2、4周組血清胰島素水平、胰腺組織Caspase-3活性、Caspase-3 mRNA表達(dá)均無明顯變化(P＞0.05)。

2.2.1 血清胰島素:間歇低氧1組血清胰島素水平隨著暴露時間的延長而升高，暴露1、2周組與常氧對照組暴露1、2周組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，暴露4周組均高于暴露1、2周組和常氧對照組暴露4周組(P＜0.05，P＜0.01);間歇低氧2組暴露1周組血清胰島素水平高于常氧對照組和間歇低氧1組暴露1周組，但僅與常氧對照組暴露1周組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，暴露2周組高于暴露1周組和常氧對照組、間歇低氧1組暴露2周組(P＜0.01，P＜0.05)，暴露4周組血清胰島素水平低于暴露1、2周組和間歇低氧1組暴露4周組(P ＜0.05，P ＜0.01)，見表2。

2.2.2 Caspase-3活性:間歇低氧1組暴露1、2、4周組胰腺組織Caspase-3活性亦無明顯變化(P＞0.05)，暴露1、2周組高于常氧對照組同時間組(P＜0.05)，暴露4周組與常氧對照組同時間組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);間歇低氧2組Caspase-3活性水平隨暴露時間延長而升高，暴露4周組高于暴露1、2周組(P＜0.05)，暴露1、2周組高于常氧對照組同時間組(P＜0.05)，暴露4周組胰腺組織Caspase-3活性水平明顯高于常氧對照組、間歇低氧1組同時間組(P＜0.01)，見表2。

2.2.3 Caspase-3 mRNA表達(dá)水平:間歇低氧1組暴露1、2、4周組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，暴露1周組Caspase-3 mRNA表達(dá)水平高于常氧對照組(P＜0.01)，暴露2、4周組與常氧對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。間歇低氧2組隨暴露時間延長Caspase-3 mRNA表達(dá)水平增高，暴露1周組高于常氧對照組(P＜0.01)，但與間歇低氧1組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);暴露2周組高于常氧對照組、間歇低氧2組暴露1周組(P＜0.05);暴露4周組Caspase-3 mRNA表達(dá)水平高于暴露1周組和常氧對照組、間歇低氧1組暴露4周組(P＜0.01)。見表2。

2.3 胰腺組織Caspase-3蛋白表達(dá)情況 常氧對照組細(xì)胞胞漿內(nèi)均未見明顯棕黃色染色。間歇低氧1組暴露1周可見棕黃色改變，但染色區(qū)域著色淺，總面積小;暴露2周可見棕黃色區(qū)域面積較暴露1周增大，可見少許明顯棕黃色顆粒;暴露4周可見棕黃色區(qū)域面積較暴露2周組略減少，偶見棕黃色顆粒。間歇低氧2組暴露1周可見棕黃色區(qū)域，與間歇低氧1組暴露1周表達(dá)相仿;暴露2周可見棕黃色區(qū)域面積較暴露1周增大，并可見棕黃色顆粒;暴露4周可見廣泛棕黃色區(qū)域，胞漿內(nèi)大量棕黃色顆粒沉積。見圖3～5。

表2 3組大鼠不同時間血清胰島素、胰腺組織Caspase-3活性、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平變化(x±s)

3 討論

2型糖尿病在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率與日俱增，預(yù)計在2025年2型糖尿病患者將達(dá)到30億，在已明確的發(fā)病原因中，2型糖尿病與年齡、種族、家族史、肥胖和久坐的生活方式相關(guān)。近年流行病學(xué)研究證實，2型糖尿病與OSAS互為危險因素，West等［5］的研究證實在2型糖尿病患者中OSAS的發(fā)病率達(dá)23%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通人群中OSAS的發(fā)病率(6%)。而一項多中心的研究數(shù)據(jù)表明，經(jīng)多導(dǎo)睡眠呼吸監(jiān)測，2型糖尿病肥胖患者中75%以上可以診斷為中、重度 OSAS［6］;OSAS患者中2型糖尿病的發(fā)病率(30．1%)明顯高于單純鼾癥患者(13.9%)［1］，除去肥胖的混淆因素，OSAS成為胰島素抵抗、糖耐量異常、2型糖尿病的獨立危險因素［7-9］，可見兩者間存在互為因果的關(guān)系。

2型糖尿病的兩個重要的病理生理機制是胰島素抵抗和胰島細(xì)胞功能障礙，而且目前也有觀點提示2型糖尿病也是一種氧化應(yīng)激性疾病［10］。OSAS引起2型糖尿病的發(fā)病機制目前公認(rèn)歸結(jié)于間歇低氧和睡眠片段化兩個基本機制［11］，其中間歇低氧起到了主導(dǎo)作用。間歇低氧已被確認(rèn)為OSAS的特征性低氧方式，各國的研究人員以建立間歇低氧的動物及細(xì)胞模型來代表OSAS的病理模型進(jìn)行研究。動物實驗已證實間歇低氧可以降低胰島素的敏感性和引起糖耐量異常，進(jìn)一步產(chǎn)生胰島素抵抗［2，12］，且可獨立于肥胖因素［2］，一項對清醒健康志愿者進(jìn)行8 h的間歇低氧(24．3個低氧事件/h)刺激的研究證實［6］，間歇低氧可以降低胰島素的敏感性及葡萄糖的利用效率，而且胰島素作用的下降并沒有伴隨著胰島素分泌的增加作為代償，研究者推測間歇低氧是OSAS患者出現(xiàn)糖代謝功能失調(diào)的主要因素，而交感神經(jīng)系統(tǒng)可能是這一病理生理現(xiàn)象的調(diào)節(jié)器。間歇低氧可以通過氧化損傷引起神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞凋亡［13-15］，對于間歇低氧條件下胰島細(xì)胞的研究還比較少，但有相關(guān)研究已證明間歇低氧可以引起胰島β細(xì)胞凋亡［3］，而本研究組前期的研究成果亦提示間歇低氧可以加重胰島細(xì)胞的氧化損傷，且褪黑素能起到一定的保護(hù)作用［16］。

高血糖是由于胰島素分泌缺陷和(或)胰島素作用缺陷而引起的。本研究結(jié)果顯示，兩種模式間歇低氧條件刺激下大鼠空腹血糖均有升高，經(jīng)過4周暴露，間歇低氧2組血糖明顯高于常氧對照組及自身未暴露時，提示間歇低氧可以引起糖代謝紊亂。然而空腹胰島素并未出現(xiàn)與血糖平行下降的結(jié)果，本研究結(jié)果顯示，間歇低氧1組胰島素水平呈緩慢升高趨勢，而間歇低氧2組在暴露2周達(dá)峰值，隨即在暴露4周明顯下降，達(dá)到常氧對照組水平，分析原因為:2型糖尿病是以外周胰島素抵抗為初始、胰島細(xì)胞功能衰竭為終結(jié)的漸進(jìn)性失調(diào)綜合征，胰島素抵抗是胰島素對其外周靶組織(肌肉、脂肪組織、肝臟)的生理效應(yīng)降低，在高血糖之前即已出現(xiàn);胰島素效應(yīng)的減弱使骨骼肌減少了對葡萄糖的攝取、利用和儲存，抑制了肝臟糖異生和糖酵解，使肝糖輸出增多，脂肪組織增加了脂解和游離脂肪酸釋放入血，慢性的脂毒性可以損傷胰島細(xì)胞，為了代償這種胰島素抵抗，胰島細(xì)胞分泌更多的胰島素產(chǎn)生高胰島素血癥，以維持糖代謝正常，隨著病程進(jìn)展，在某一節(jié)點，胰島細(xì)胞功能進(jìn)行性受損不能再代償這種胰島素抵抗，即出現(xiàn)血糖升高。本研究結(jié)果也提示間歇低氧可引起高胰島素血癥。已有相關(guān)的研究證實，間歇低氧本身即可引起胰島素抵抗［2］。本研究結(jié)果顯示，間歇低氧2組在暴露4周時出現(xiàn)胰島素水平下降，說明引起了胰島細(xì)胞功能受損，但遺憾的是，本研究并未圍繞胰島素抵抗進(jìn)行，故不能以單純的高胰島素血癥得出胰島素抵抗的結(jié)論。

Caspase家族是公認(rèn)的在哺乳動物細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用的物質(zhì)，Caspase-3是經(jīng)典的凋亡因子。本研究結(jié)果顯示，Caspase-3在間歇低氧1組表達(dá)呈現(xiàn)暴露2周升高、暴露4周回落的趨勢，在一定程度反映了可能存在著機體的適應(yīng)機制;Caspase-3 mR-NA雖然在表達(dá)趨勢方面與蛋白表達(dá)一致，暴露2周呈現(xiàn)高表達(dá)卻與常氧對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明此組數(shù)據(jù)組間差異非常大，故不能以此組數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)的推論。在間歇低氧2組Caspase-3活性及其mRNA和蛋白表達(dá)均呈現(xiàn)進(jìn)行性增加的趨勢，說明間歇低氧2組隨著間歇低氧方式的改變及暴露時間的延長，胰腺組織內(nèi)凋亡細(xì)胞明顯增多。曾有研究報道不同時程的間歇低氧對大鼠的影響是不同的，美國華盛頓喬治納州大學(xué)醫(yī)學(xué)院以間歇低氧(6%氧2 min，21%氧2 min)，8 h/d，分別暴露1、2、4周，研究者發(fā)現(xiàn)在暴露時間為2周時氧化損傷最嚴(yán)重，心臟對缺血再灌注損傷最為敏感［17］，本研究結(jié)果與此一致。提示實驗大鼠可能對淺而快的間歇低氧模式產(chǎn)生了一定的適應(yīng)反應(yīng)，深而慢的間歇低氧模式對機體的損傷呈進(jìn)行性加重。

圖3 3組大鼠暴露1周胰腺組織Caspase-3蛋白表達(dá)(SP×100)A．常氧對照組;B．間歇低氧1組;C．間歇低氧2組

圖4 3組大鼠暴露2周胰腺組織Caspase-3蛋白表達(dá)(SP×100)A．常氧對照組;B．間歇低氧1組;C．間歇低氧2組

圖5 3組大鼠暴露4周胰腺組織Caspase-3蛋白表達(dá)(SP×100)A．常氧對照組;B．間歇低氧1組;C．間歇低氧2組

對比兩種不同模式的間歇低氧，間歇低氧1組相對應(yīng) AHI為21/h，間歇低氧2組為10/h，按照OSAS嚴(yán)重程度來評估，間歇低氧1組應(yīng)為中度，間歇低氧2組應(yīng)為輕度，然而兩組實驗數(shù)據(jù)分析顯示，間歇低氧2組對機體的損傷更嚴(yán)重，由此筆者認(rèn)為，對于OSAS患者的病情嚴(yán)重程度不應(yīng)單純依靠AHI作為判定的唯一指標(biāo)，還應(yīng)綜合患者整體每次呼吸暫停發(fā)作延續(xù)時間的長短，以及其上氣道塌陷的程度等多種指標(biāo)進(jìn)行綜合評估，以免延誤病情以及造成醫(yī)療資源的浪費。《阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征診治指南(2011年修訂版)》指出，應(yīng)當(dāng)充分考慮患者臨床癥狀、合并癥情況，結(jié)合AHI及夜間動脈血氧飽和度(SaO2)等指標(biāo)，可按照AHI和夜間最低SaO2對患者病情分別分度。由于臨床有些OSAS患者AHI和SaO2變化程度不平行，因此推薦以AHI為判斷病情的主要標(biāo)準(zhǔn)，同時注明低氧血癥水平。

本實驗還存在不足之處，應(yīng)進(jìn)行更長時間的間歇低氧暴露，選取多靶位器官進(jìn)行研究，以更準(zhǔn)確地反映兩種間歇低氧模式對機體的影響。

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