冬蟲夏草腎保護(hù)的分子生物學(xué)機(jī)制研究進(jìn)展

劉乃琴，邵 卉，趙香芳(綜述)，常連慶(審校)

(解放軍第四六四醫(yī)院內(nèi)分泌科，天津 300381)

冬蟲夏草是中華蟲草菌寄生于蟲草蝙蝠蛾幼蟲體后發(fā)育成的真菌子座與充滿菌絲的僵死幼蟲的復(fù)合體，其有效成分主要有：核苷類物質(zhì)、蟲草多糖、麥角甾醇、D-甘露醇、多種氨基酸、蟲草素等。冬蟲夏草能調(diào)節(jié)免疫功能、抗腫瘤，對中樞神經(jīng)、心、肺、肝、腎、血液、代謝及內(nèi)分泌也具有調(diào)節(jié)和保護(hù)作用[1]。隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，探索天然冬蟲夏草及其人工制劑對腎臟保護(hù)作用的動物實(shí)驗(yàn)已取得了長足的發(fā)展。

1 冬蟲夏草改善腎纖維化的分子生物學(xué)機(jī)制

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)已成為終末期腎病最常見的病因。腎臟細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過度蓄積及降解減少所引起的腎小球硬化與間質(zhì)纖維化是DN進(jìn)展的主要病理學(xué)表現(xiàn)。ECM的主要成分——膠原、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)等的異常增高提示ECM的過度積聚[2]。多種成分參與小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生過程。冬蟲夏草可以從多個靶點(diǎn)延緩腎間質(zhì)纖維化。

1.1轉(zhuǎn)化生長因子β及原癌基因c-myc 轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor,TGF-β)是慢性腎病發(fā)病的關(guān)鍵細(xì)胞因子，它通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化、增加ECM的聚集、促進(jìn)基質(zhì)分子表面受體整合素的表達(dá)等促使腎小球肥大、纖維化。c-myc與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，其可能直接參與細(xì)胞生長的調(diào)控。

研究證明，糖尿病大鼠模型應(yīng)用TGF-β抗體后，c-myc表達(dá)減少，腎臟肥大和纖維化減輕。胡楊青等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，DN鼠腎組織中TGF-β、c-myc表達(dá)上調(diào)，提示c-myc可能是TGF-β下游的靶基因,共同參與ECM增多及腎小球纖維化；冬蟲夏草干預(yù)使DN鼠尿蛋白排泄量及血肌酐水平顯著下降，TGF-β、c-myc表達(dá)明顯下調(diào)，說明冬蟲夏草可抑制腎組織TGF-β、c-myc的表達(dá)，對早期DN起保護(hù)作用。還有研究顯示，DN大鼠腎組織TGF-β及其受體mRNA、FN mRNA均呈高表達(dá)；冬蟲夏草呈時間-劑量依賴性降低DN大鼠24 h尿蛋白排泄率及血肌酐水平，推測冬蟲夏草可通過下調(diào)腎組織TGF-β及其受體、FN mRNA的表達(dá)，降低腎內(nèi)TGF-β活性，延緩DN進(jìn)展[4]。

1.2結(jié)締組織生長因子 結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)在腎小球和腎間質(zhì)的高表達(dá)也是導(dǎo)致腎纖維化的重要原因。激活后的CTGF可介導(dǎo)TGF-β的致纖維化作用。有研究發(fā)現(xiàn)，DN大鼠腎組織內(nèi)TGF-β1、膠原 Ⅳ及CTGF呈高表達(dá)；冬蟲夏草干預(yù)可減輕腎組織的病理損傷，下調(diào)TGF-β1、CTGF、膠原 Ⅳ的表達(dá)，推測冬蟲夏草通過下調(diào)TGF-β1、CTGF的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)對DN的保護(hù)及抗腎小球纖維化作用[5]。還有研究證明，冬蟲夏草通過下調(diào)殘腎組織內(nèi)CTGF表達(dá)而抑制5/6腎切除大鼠的腎臟纖維化，改善腎功能[6]。

1.3組織蛋白酶B、胱抑素C 組織蛋白酶B(cathepsin B，CB)是半胱氨酸蛋白酶超家族的主要成員，參與ECM的降解。CB表達(dá)減少和/或活性降低是ECM蓄積的重要原因之一。胱抑素C通過抑制CB活性，促進(jìn)腎纖維化的形成。方華偉等[7]研究表明，隨著病程進(jìn)展，糖尿病大鼠腎組織CB、胱抑素C比例失衡，導(dǎo)致ECM沉積，腎組織纖維化加重；冬蟲夏草治療可上調(diào)CB表達(dá)，下調(diào)胱抑素C、膠原 Ⅳ及FN的表達(dá)，恢復(fù)CB、胱抑素C的動態(tài)平衡，延緩DN大鼠腎組織纖維化。

1.4成纖維細(xì)胞特異性蛋白1 有研究顯示，5/6腎切除大鼠的腎組織鏡下可見腎小球硬化和腎小管萎縮，間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤，ECM沉積增多，足突融合，線粒體腫脹、空泡變性甚至嵴溶解、消失，自噬小體形成等；成纖維細(xì)胞特異性蛋白1、FN、膠原 Ⅲ的mRNA及蛋白表達(dá)均顯著增加；冬蟲夏草治療可明顯逆轉(zhuǎn)上述異常[8]。郭山脈等[9]的研究結(jié)果也證實(shí)了冬蟲夏草能夠通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、減輕線粒體損傷、抑制ECM沉積等以拮抗腎臟纖維化。

1.5組織型纖溶酶原激活物、纖溶酶原激活物抑制劑 纖溶酶原激活后可直接或間接降解ECM。糖尿病時，高血糖、高胰島素可促使纖溶酶原激活物抑制劑1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)/組織型纖溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator,t-PA)比例失調(diào)，致纖溶酶原活化減少。有研究證實(shí)，DN大鼠中PAI-1表達(dá)明顯增多、t-PA表達(dá)明顯減少，病理顯示腎小球肥大，ECM增多，腎小管萎縮；冬蟲夏草干預(yù)后，DN大鼠腎臟病理改變減輕，t-PA/PAI-1紊亂得到部分糾正，提示冬蟲夏草可通過糾正纖溶酶原系統(tǒng)的紊亂治療DN，且干預(yù)越早效果越好[10]。

1.6Dickkopf-1、β聯(lián)蛋白 Wnt/β聯(lián)蛋白是調(diào)控系膜細(xì)胞功能的重要細(xì)胞內(nèi)信號通路之一。Wnt通過抑制β聯(lián)蛋白的磷酸化降解、增加細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β聯(lián)蛋白水平，從而對c-myc、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、FN等的表達(dá)起重要調(diào)控作用[11]。Wnt/β聯(lián)蛋白在高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，可導(dǎo)致系膜細(xì)胞的凋亡和蛋白尿[12]。Dickkopf-1(DKK-1)為Wnt/β聯(lián)蛋白信號通路的拮抗劑,通過介導(dǎo)β聯(lián)蛋白的磷酸化，促進(jìn)TGF-β、FN等的表達(dá)，導(dǎo)致系膜細(xì)胞纖維化[13]。杜月娟等[14]研究顯示，DN大鼠腎小球系膜細(xì)胞、足突細(xì)胞FN、DKK-1的mRNA及蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，β聯(lián)蛋白表達(dá)明顯減少，而β聯(lián)蛋白mRNA無明顯改變；冬蟲夏草治療后，F(xiàn)N、DKK1 mRNA及蛋白表達(dá)顯著減少，β聯(lián)蛋白增加，β聯(lián)蛋白mRNA和血糖無明顯變化；證實(shí)DN時DKK-1升高參與了腎臟ECM的沉積，Wnt信號通路受抑制致使β聯(lián)蛋白降解增加，冬蟲夏草通過抑制DKK-1、穩(wěn)定β聯(lián)蛋白而發(fā)揮非依賴降糖的腎臟保護(hù)作用。

1.7Nephrin、Podocin 近年研究表明，足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變及其裂孔膜蛋白Nephrin和Podocin在DN的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[15]。Nephrin、Podocin的mRNA表達(dá)與蛋白尿程度呈顯著負(fù)相關(guān)。新近研究顯示，DN大鼠經(jīng)冬蟲夏草治療后，腎小球肥大、腎小管變形明顯減輕，足細(xì)胞的病理改變顯著改善，Nephrin和Podocin表達(dá)明顯增加，提示冬蟲夏草可能通過上調(diào)Nephrin和Podocin蛋白的表達(dá)而發(fā)揮保護(hù)及修復(fù)足細(xì)胞的作用[16]。還有研究顯示，冬蟲夏草與雷公藤多苷具有相同的足細(xì)胞保護(hù)作用，兩者聯(lián)合可明顯增加療效，且冬蟲夏草可以明顯減輕雷公藤多苷引起的肝損害、骨髓抑制等不良反應(yīng)[17]。

2 急性腎損傷

近年來，急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)的發(fā)生率逐年升高。早期發(fā)現(xiàn)AKI并采取積極有效的治療措施將有助于延緩或逆轉(zhuǎn)AKI發(fā)展為多器官功能衰竭或終末期腎病。

2.1尿白細(xì)胞介素18、N-乙酰-β-葡萄糖苷酶 目前研究認(rèn)為缺血誘導(dǎo)白細(xì)胞介素18表達(dá)增多。白細(xì)胞介素18不僅參與腎小管的損傷，也可以作為AKI早期診斷和療效判斷的生物學(xué)標(biāo)志物[18]。N-乙酰-β-葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-glucosaminidase，NAG)在AKI時經(jīng)尿排出增多，它是近端腎小管損傷的生物學(xué)標(biāo)志物。新近研究顯示，缺血再灌注模型組大鼠尿素氮、血肌酐、尿NAG和尿白細(xì)胞介素18水平顯著增高，證實(shí)尿NAG和白細(xì)胞介素18均可作為腎小管損傷的敏感指標(biāo)；冬蟲夏草有較好的腎保護(hù)作用，可能與抑制白細(xì)胞介素18、NAG的排出有關(guān)[19]。

2.2腎損傷分子1、一氧化氮 腎損傷分子1(kidney injury molecule-1，Kim-1)是一種新的Ⅰ型跨膜蛋白，腎缺血及腎毒性損傷時誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞持續(xù)高表達(dá)[20]，Kim-1在早期AKI的診斷中有重要意義[21]。一氧化氮(nitric oxide，NO)是內(nèi)源性血管舒張因子，與氧化應(yīng)激關(guān)系密切，在腎缺血再灌注損傷中有促細(xì)胞凋亡的作用[22]。

洪學(xué)敏等[23]通過抗霉素A刺激大鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)模擬體外缺血再灌注損傷過程，結(jié)果顯示NRK-52E細(xì)胞受刺激后其凋亡率顯著增高，與Kim-1 mRNA的早期高表達(dá)、NO濃度升高呈直線正相關(guān)；冬蟲夏草可通過下調(diào)Kim-1的表達(dá)、降低 NO濃度、抑制細(xì)胞凋亡、減輕氧化應(yīng)激而發(fā)揮腎保護(hù)作用。

2.3缺氧誘導(dǎo)因子1、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白 由缺血引起的AKI中，缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)扮演著保護(hù)因子的角色，有望成為AKI早期診斷的標(biāo)志物。余洪磊等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注導(dǎo)致AKI發(fā)生時，尿NGAL濃度明顯升高，腎組織中HIF-1 mRNA及蛋白、NGAL蛋白的表達(dá)均明顯升高，這種異常表達(dá)與腎小管及間質(zhì)損傷程度密切相關(guān)；冬蟲夏草能有效逆轉(zhuǎn)上述異常，減輕腎小管及間質(zhì)損傷，推測冬蟲夏草對缺血再灌注引起的AKI的保護(hù)作用可能是通過上調(diào)HIF-1和NGAL的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

3 高血壓腎病

腎小管間質(zhì)的損害程度與腎功能密切相關(guān)，腎小管上皮細(xì)胞凋亡在腎小管間質(zhì)病變的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

3.1Klotho、p53、p21、胱天蛋白酶3 Klotho基因是一種主要表達(dá)于腎臟遠(yuǎn)端小管上皮細(xì)胞的抗衰老基因[25]；p53和p21是重要的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子，Klotho基因可通過p53～p21通路對細(xì)胞衰老和凋亡進(jìn)行調(diào)控；胱天蛋白酶3是兩條主要細(xì)胞凋亡通路(死亡細(xì)胞凋亡通路和線粒體凋亡通路)的交匯點(diǎn)，活化的caspase-3是凋亡的執(zhí)行者。

有研究顯示，冬蟲夏草可使自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)24 h尿蛋白、尿NAG、血肌酐及尿素氮顯著減少，腎臟病理損害減輕，Klotho表達(dá)顯著上調(diào)，p53、p21及活化的caspase-3表達(dá)顯著下調(diào)，腎小管上皮細(xì)胞凋亡顯著減少，提示冬蟲夏草可能是通過促進(jìn)Klotho的表達(dá)、抑制p53～p21凋亡通路及caspase-3活化而抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡[26]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，冬蟲夏草可呈濃度依賴地促進(jìn)NRK-52E增殖,劑量依賴地抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的NRK-52E凋亡、降低caspase-3酶活性[27]。

Klotho基因還具有增加細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的能力[28]。唐榮等[29]應(yīng)用冬蟲夏草對SHR進(jìn)行干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，腎功能指標(biāo)得到改善，Klotho表達(dá)增強(qiáng)，丙二醛水平顯著降低，抗氧化酶類活性有不同程度的恢復(fù)，腎組織病理損傷明顯減輕，表明冬蟲夏草可通過直接抗氧化應(yīng)激或部分通過上調(diào)klotho基因的表達(dá)抑制氧化應(yīng)激，對SHR起到腎保護(hù)作用。

1.3.2細(xì)胞間黏附分子1、血管細(xì)胞黏附分子1 炎性介質(zhì)如細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)等的表達(dá)在高血壓靶器官損害中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，SHR大鼠的尿蛋白排泄量明顯增加，腎間質(zhì)小動脈、細(xì)動脈管壁增厚，血管周圍大量炎細(xì)胞浸潤，部分腎間質(zhì)出現(xiàn)纖維化，腎組織中ICAM-1和VCAM-1 mRNA及蛋白水平明顯增加；冬蟲夏草干預(yù)組血壓雖無明顯下降，但其他異常得到明顯糾正，提示冬蟲夏草可能通過抑制SHR腎組織炎性因子的表達(dá)而發(fā)揮非血壓依賴性的抗炎、保腎作用[30]。

4 小 結(jié)

DN、高血壓腎病、AKI時，TGF-β、c-myc、CTGF、成纖維細(xì)胞特異性蛋白1、胱抑素C、PAI-1、DKK-1、Nephrin、Podocin、Kim-1、NGAL、ICAM-1、VCAM-1、p53、p21及活化的caspase-3等表達(dá)上調(diào)；而CB、t-PA、β聯(lián)蛋白、HIF-1、Klotho等表達(dá)下調(diào)，促發(fā)腎間質(zhì)纖維化、足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變、腎小管上皮細(xì)胞凋亡等，最終損害腎功能。冬蟲夏草可多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)逆轉(zhuǎn)上述異常，保護(hù)腎功能。但是腎臟疾病往往是多致病因素、多機(jī)制參與的結(jié)果，欲將動物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為臨床所用仍需要進(jìn)行大規(guī)模、長時間、高質(zhì)量的前瞻、隨機(jī)、雙盲對照試驗(yàn)，必須在循證醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)上獲取更多證據(jù)。

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