腦缺血再灌注損傷對神經元線粒體DNA影響的研究進展

王亞芳綜述 宋春雨審校

綜 述

腦缺血再灌注損傷對神經元線粒體DNA影響的研究進展

王亞芳綜述 宋春雨審校

腦缺血再灌注損傷；神經元線粒體DNA；進展

心腦血管疾病是人類死亡的頭號殺手，近年來隨著醫(yī)療技術的發(fā)展，溶栓治療已廣泛應用于臨床，腦缺血后再灌注期間組織損傷加重及各種繼發(fā)改變已日益受到重視。線粒體作為細胞的核心細胞器之一，其在腦缺血再灌注(ischemia/reperfusion injury，IRI)中的相關研究已取得了較大進展，已經從細胞、分子水平深入到線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)水平?，F(xiàn)對腦IRI過程中mtDNA的影響進行概述。

1 腦IRI與mtDNA

1.1 腦IRI 腦IRI是一個復雜的病理生理過程，是指腦組織缺血缺氧致神經元損傷，恢復血液灌流后，其損傷反而進一步加重的現(xiàn)象。主要包括缺血期的原發(fā)性損傷和再灌注期的繼發(fā)性損傷，最終造成神經細胞損傷、凋亡、壞死，主要與神經元缺血缺氧引起的自由基損傷、細胞Ca2+離子超載、炎性因子的損傷、興奮性氨基酸的神經毒性作用以及基因表達變異等因素有關[1]。其中線粒體內鈣超載和自由基(reactive oxygen species，ROS)連鎖反應是腦IRI的核心環(huán)節(jié)。

1.2 線粒體DNA 線粒體是一種半自主性的細胞器，擁有自身的遺傳體系——mtDNA，由于其自身比較獨特的遺傳特性而被廣泛應用于人類群體的研究。mtDNA是一個具有16 569個堿基對的反向雙鏈閉環(huán)分子，為核外遺傳物質，參與編碼12S和16S兩種rRNA，22種tRNA及13種與氧化磷酸化相關的多肽，包括復合體I(NADH-泛醌還原酶)中6個亞基(ND1/ND2/ND3/ND4/ND5和ND6)；復合物III(細胞色素C還原酶)中1個亞基(Cytb);復合物IV(細胞色素氧化酶，CO)中2個亞基(ATPase6和ATPase80)[2]。所以mtDNA的任何缺失和/或突變都有可能對線粒體功能產生影響，進而導致個體的功能障礙。mtDNA與線粒體內膜(氧化磷酸化的場所)在空間上距離相近，因而易受到線粒體呼吸鏈產生的自由基的攻擊,如mtDNA鏈上的脫氧鳥苷(dG)可轉化成羥基脫氧鳥苷(8-OH-dG),造成mtDNA的突變和/或缺失；而且mtDNA由于自身結構的特殊性，如缺乏組蛋白的保護、復制速度快、無校讀功能、缺乏有效的DNA修復酶，極易受到損傷而產生突變[3]。mtDNA的突變形式包括核酸片段的丟失，堿基修飾及插入突變等，其中常見的是核酸片段的丟失，在人類缺失最普遍的是4977bp(第8470-13447位堿基)片段缺失，在大鼠相對應最常見的就是4834bp(第8103-12937位堿基)片段缺失。

1.3 IRI與mtDNA的關系 線粒體是細胞內氧化磷酸化、三羧酸循環(huán)及電子傳遞的重要場所，不僅為細胞的活動提供了能量，在維持細胞氧化還原狀態(tài)、pH維持及滲透壓調節(jié)、鈣穩(wěn)態(tài)及細胞信號轉導中起重要作用。線粒體是氧化應激的首要靶細胞器，線粒體損傷可以導致線粒體功能代謝障礙和鈣離子失衡，并促進線粒體釋放促凋亡因子(如細胞色素C)和凋亡誘導因子(AIF)[4],同時mtDNA的損傷，最終導致細胞壞死或凋亡。

腦缺血再灌注損傷會導致腦病灶區(qū)ROS大量激活，這是IRI的 損傷根源之一，而線粒體作為氧化磷酸化的主要場所，是細胞內ROS的主要來源，通過消耗大量氧產生過量的ROS,繼而損傷機體各種脂質、蛋白質、核酸。同時，在腦IRI期間各種繼發(fā)產物引起線粒體通透性轉換通道(permeabi transition pore,PTP)開放，造成線粒體ATP合成障礙;缺血、缺氧條件下，線粒體會釋放介導細胞凋亡的分子：凋亡誘導因子、白細胞介素-1和細胞色素C等，激活各種級聯(lián)反應，最終導致細胞凋亡[2，5]。細胞核基因針對ROS的這類損傷的修復主要通過對損傷DNA堿基的切除修復這一途徑，但是mtDNA缺乏對損傷的自我修復能力，加之空間上與ROS的產生部位相近，所以易受ROS攻擊導致mtDNA缺失和/或突變。線粒體是細胞的一部分，對線粒體的損傷即是對細胞的損害；而線粒體結構功能受損的同時，其自身遺傳體系——mtDNA不可避免受到影響，使細胞功能障礙，最終導致細胞壞死、凋亡[6]。McDonald等[7]在臨床中發(fā)現(xiàn)，急性腦損傷后長時程存活者會發(fā)生mtDNA 4977bp和7436bp的缺失，但是在短時程存活者并未檢測出這些基因片段的缺失，并認為這可能是短暫暴露于腦缺血引起的自由基環(huán)境不足以使mtDNA形成缺失，但是要造成mtDNA 4977bp和7436bp缺失所需的mtDNA損傷時間在此研究中還未明確。適量的有氧運動能夠促進機體有氧代謝，減少機體ROS的產生。Zhang[8]等在對腦缺血大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，經過7 d適量的踏板運動，腦缺血大鼠神經細胞線粒體及mtDNA數(shù)量、線粒體轉錄因子A、線粒體蛋白質細胞色素C氧化酶亞基IV(COXIV)、熱休克蛋白60(HSP60)水平均升高,這可能與ROS的減少有密切的關系，但該研究并未對此做深入研究。

2 腦IRI對mtDNA的影響及可能機制

2.1 腦IRI對mtDNA的作用 Chen等[9]利用大鼠局部腦IRI模型發(fā)現(xiàn)，長時間局部腦缺血會導致mtDNA永久損傷；而mtDNA的復制依賴于轉錄，但線粒體自身并不包含全部的mtDNA修復機制[10]，另一方面其獨特的結構也決定了其在腦IRI中的易損性。Nadasi等[11]在臨床中發(fā)現(xiàn)，在新生兒監(jiān)護病房死亡的新生兒各臟器標本進行PCR檢測時發(fā)現(xiàn)，受檢樣本中普遍存在mtDNA 4799堿基對的缺失，而此片段是mtDNA編碼線粒體呼吸鏈復合物、氧化磷酸化成分的核心片段，其缺失可能與圍產期缺氧存在相關性。如前文所述，在大鼠腦IRI中mtDNA 4834bp缺失最為常見，該片段負責編碼氧化磷酸化及電子傳遞過程中的多個重要亞基，如細胞色素C氧化酶亞單位III、ATP合成酶IV等。Chandrasekaran等[12]在利用沙鼠全腦缺血模型研究缺血缺氧與mtDNA的關系時發(fā)現(xiàn)，腦缺血后沙鼠海馬區(qū)CA1神經元中，由mtDNA編碼的細胞色素氧化酶亞單位III mRNA表達顯著減低。

2.2 ROS與mtDNA 如前文所述，腦IRI時的組織缺氧缺血使線粒體內外環(huán)境發(fā)生重大變化，線粒體膜電位下降，膜通透性增加，加重細胞內鈣超載，神經元蛋白質、脂質代謝障礙，磷脂酶激活，伴隨著線粒體氧化磷酸化脫偶聯(lián)，大部分被電子傳遞鏈傳來的電子還原為水，小部分氧被電子傳遞鏈中漏流出來的電子單價還原，形成超氧陰離子，并經歧化作用產生過氧化氫，大量ROS生成，繼發(fā)ROS的mtDNA損傷作用[13]。

雖然腦IRI后神經細胞死亡的機制還未明確，但線粒體通過大量ROS產生激活信號轉導途徑調節(jié)依賴線粒體的凋亡途徑已得到廣泛認可。而ROS主要是線粒體氧化呼吸過程中由呼吸鏈復合體I和復合體III產生的，且復合體I和復合體III均是mtDNA編碼的，所以mtDNA作為線粒體不可缺少的一部分，易受到ROS影響[13～15]。Savu等[16]在大鼠糖尿病模型中利用PCR檢測技術發(fā)現(xiàn)，由高糖和缺氧引發(fā)的線粒體產ROS增多，可以導致mtDNA的損傷，Savu還發(fā)現(xiàn)這種ROS導致的mtDNA損傷可能是由于mtDNA的復制缺陷及其基本修復功能有關。Napoli等[17]在孤獨癥譜系障礙患兒的研究中發(fā)現(xiàn)，完全自閉患兒較一般自閉患兒mtDNA缺失頻率更高，損傷更重，且在完全自閉患兒中mtDNA主要出現(xiàn)GC堿基轉換為AT堿基，而ROS更傾向于攻擊GC堿基，所以Napoli認為 ROS與自閉患兒的mtDNA損傷有一定的相關性。Cassano等[18]在研究老年大鼠時檢測到了肝臟和腦mtDNA 4834bp的缺失，而自由基理論是目前解釋老齡變化這一多分子參與過程的重要理論之一，故得出mtDNA4834bp缺失與老齡化中ROS相關。

2.3 凋亡相關因子與mtDNA 腦IRI會同時激活各種凋亡因子(Bcl-2/Bax、P53)，促進以線粒體為關鍵環(huán)節(jié)的凋亡級聯(lián)反應，導致蛋白質變性、DNA(核DNA、mtDNA)降解、染色質凝聚，最終細胞凋亡。腦缺血缺氧性損傷后，細胞內Ca2+濃度升高，導致細胞外谷氨酸鹽濃度升高，繼發(fā)誘導Bax蛋白表達升高，Bax通過作用于線粒體[19]，導致mtDNA發(fā)生變化。研究發(fā)現(xiàn)在氧化應激時，Bcl-2能促進腫瘤細胞核編碼細胞色素C氧化酶Va進入線粒體，并降低線粒體內細胞色素C氧化酶Vb，調節(jié)線粒體氧化呼吸，抑制ROS水平升高而間接減輕對mtDNA的影響[20]。Park等[21]、Lebedeva等[22]研究發(fā)現(xiàn)，P53不僅能夠調節(jié)線粒體的有氧代謝，而且能夠調節(jié)mtDNA的缺失、線粒體的數(shù)量和線粒體氧保護作用。實驗發(fā)現(xiàn)，缺乏P53基因的纖維母細胞出現(xiàn)線粒體數(shù)量和超氧化物水平降低，過氧化氫水平升高等自由基環(huán)境紊亂。事實上，在大鼠和人類纖維母細胞,P53定位于線粒體，通過自身核轉錄因子活性調節(jié)線粒體的有氧呼吸，在促進細胞凋亡的同時抑制mtDNA發(fā)生突變[22]。

另外，作為較理想的DNA氧化損傷的生物標記物，OH8dG也引起了生物醫(yī)學界的廣泛興趣。OH8dG不阻斷mtDNA的復制，但可以造成OH8dG本身、鄰近堿基的錯讀以及局部DNA構型的改變，最終導致mtDNA雙鏈斷裂,使mtDNA結構變化，進而引起mtDNA功能受損，最終導致機體功能障礙或疾病的產生。缺氧可導致OH8dG在大鼠腦神經元mtDNA中含量顯著增加，并改變DNA修復酶表達水平，繼發(fā)對mtDNA產生影響[23]。

3 展望

隨著對腦IRI機制研究的深入，研究者對損傷過程中的核心細胞器——線粒體損傷的研究已經深入到mtDNA層次，但是具體的病理生理機制沒有明確。一方面mtDNA由于特殊的自身結構和復制修復系統(tǒng)，在腦缺血缺氧過程中極易發(fā)生突變；另一方面，mtDNA是動物細胞核染色體外惟一的遺傳物質，mtDNA突變可累及腦或其他器官組織，引起多種疾病，目前只能作對癥治療，雖然針對mtDNA的基因治療手段已經有一些嘗試，但進展緩慢[24]。

隨著臨床溶栓治療技術的廣泛應用與發(fā)展，腦IRI已成為臨床腦科疾病常見的重要病理生理反應，因此，有待在現(xiàn)有研究基礎上對其mtDNA層次的損傷機制作進一步的探索和研究。線粒體基因突變可引起個體線粒體功能異常進而導致一些疾病，且一般都是遺傳性疾病，如線粒體肌病等，一般的治療手段只是對現(xiàn)有病情的緩解，但是通過輸入線粒體特定tRNAs、細胞核移植等基因治療手段可以將突變的mtDNA去除，使線粒體疾病得到更徹底的治療[25]，也許不久的將來，基因治療也會成為臨床腦科疾病的重要手段之一。

1 宋文婷，徐立，劉建勛.腦缺血后谷氨酸及其受體介導的神經細胞損傷及相關藥物研究進展[J].中國藥理學通報，2012，28(6):747-750.

2 Christophe M,Nicolas S.Mitochondria:a target for neuroprotective interventions in cerebral ischemia-reperfusion[J].Curr Pharm Des,2006,12(6):739-757.

3 Druzhyna NM,Wilson GL,LeDoux SP.Mitochondrial DNA repair in aging and disease[J].Mech Ageing Dev,2008,129(7-8):383-390.

4 Clavton DA.Replication of animal mitochondrial DNA[J].Cell,1982,28(4):693-705.

5 Niizuma K,Yoshioka H,Chen H,et al.Mitochondrial apoptotic neuronal death signaling pathways in cerebral ischemia[J].Biochim Biophys Acta,2010,1802(1):92-99.

6 Sola S, Morgado AL, Rodrigues CM. Death receptors and mitochondria: two prime triggers of neural apoptosis and differentiation [J].Biochim Biophys Acta,2013,1830(1):2160-2166.

7 McDonald RP,Horsburgh KJ,Graham DJ,et al.Mitochondrial DNA deletions in acute brain injury[J].Neuroreport，1999,10(9):1875-1878.

8 Zhang Q,Wu Y,Zhang P,et al.Exercise induces mitochondrial biogenesis after brain ischemia in rats[J].Neuroscience,2012,205:10-17.

9 Chen H,Hu CJ,He YY,et al. Reduction and restoration of mitochondrial DNA content after focal cerebral ischemia/reperfusion [J].Stroke,2001,32(10):2382-2387.

10 Cline SD.Mitochondrial DNA damage and its consequences for mitochondrial gene expression[J]. Biochimicaet Biophysica Acta，2012,1819(9-10):979-991.

11 Nadasi EA, Melegh B,Seress L,et al.Mitochondrial DNA4977 deletion in brain of newborns died after intensive care[J].Acta Bilo Hung,2003,54(3-4):253-262.

12 Chandrasekaran K,Mehrabian Z,Spinnewyn B,et al.Neuroprotective effects of bilobalide,a component of Ginkgo biloba extract(CGb761)in global brain ischemia and in excitotoxicity-induced neuronal death[J].Pharmacopsychiatry,2003,36(Suppl 1):S89-94.

13 Ploszaj T,Robaszkiewicz A, Witas H. Oxidative damage of mitochondrial DNA:the result or consequence of enhanced generation of reactive oxygen species[J].Postepy Biochen,2010,56(2):139-146.

14 Costa RA,Romagna CD,Pereira JL,et al.The orle of mitochondrial DNA damage in the citotoxicity of reactive oxygen species[J].J Bioenerg Biomembr,2011,43(1)25-29.

15 Sanderson TH,Revnolds CA,Kumar R,et al.Molecular mechanisms of ischemia-reperfusion injury in brain:pivotal role of the mitochondrial membrane potential in reactive oxygen species generation[J].Mol Neurobiol,2013,47(1):9-23.

16 Savu O,Sunkari VG,Botusan IR,et al.Stability of mitochondrial DNA against reactive oxygen species(ROS) generated in diabetes[J].Biabetes Metab Res Rev，2011,27(5):470-479.

17 Napoli E,Wong S,Giulivi C.Evidence of reactive oxygen species-mediated damage to mitochondrial DNA in children with typical autism[J].Mol Autism，2013,4(1):2.

18 Cassano P,Lezza AM,Leeuwenburgh C,et al. Measurement of the 4,834-bp mitochondrial DNA deletion level in aging rat liver and brain subjected or not to caloric restriction diet [J].Ann NY Acad Sci，2004,1019:269-273.

19 Xi HJ, Zhang TH, Tao T, et al. Propofol improved neurobehavioral outcome of cerebral ischemia-reperfusion rats by regulating Bcl-2 and Bax expression [J].Brain Res,2011, 1410(9):24-32.

20 Chen ZX,Pervaiz S .Involvement of cytochrome c oxidase subunits Va and Vb in the regulation of cancer cell metabolism by Bcl-2[J].Cell Death Differ,2010,17(3):408-420.

21 Park JY,Wang PY,Matsumoto T,et al .P53 impproves aerobic exercise capacity and augments skeletal muscle mitoxhondrial DNA content[J].Circ Res,2009,105(7): 705-712.

22 Lebedeva MA,Eaton JS,Shadel GS.Loss of P53 causes mitochondrial DNA depletion and altered mitochondrial reactive oxygen species homeostasis[J].Biochim Biophys Acta,2009,1787:328-334.

23 Lee HM,Wang C,Hu Z,et al.Hypoxia induces mitochondrial DNA damage and stimulates expression of a DNA repair enzyme,the Escherichia coliMutY DNA glycosylase homolog(MYH),in vivo,in the rat brain[J].J Neurochem,2002,80(5):928-937.

24 曹佐武.線粒體病的基因治療[J].暨南大學學報，2011,32(2)：122-125.

25 Escames G,Lopez LC,Garcia JA,et al.Mitochondrial DNA and inflammatory disease[J].Hum Genet，2012,131(2):161-173.

150086 哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院麻醉科，黑龍江省麻醉與危重病學重點實驗室，黑龍江省普通高等學校 麻醉基礎理論與應用研究重點實驗室 通訊作者：宋春雨，E-mail:13936130754@163.com

10.3969/ j.issn.1671-6450.2014.02.042

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