miR-196b慢病毒表達載體的構(gòu)建和功能鑒定

劉 玥，帥 春，尹 虹，宋艷斌*，馬文麗*

（1.南方醫(yī)科大學(xué)基因工程研究所，廣東廣州510515;2.廣東省婦幼保健院新生兒科越秀院區(qū)，廣東廣州 510000）

miRNA可通過與靶mRNA特異性堿基互補配對，引起靶mRNA降解或者抑制翻譯，進而對基因進行轉(zhuǎn)錄后表達調(diào)控［1］。miR-196b位于7號染色體短臂（7p15.2），其高表達和許多腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，如口腔癌［2］、胃癌［3］和鼻咽癌［4］等，也可作為胰腺上皮內(nèi)瘤變的診斷標志物［5］，并可判斷成膠質(zhì)細胞瘤和間變性星形細胞瘤患者的預(yù)后［6］。miR-196b和白血病的關(guān)系也很密切，其在混合系白血病（Mixed Lineage Leukemia，MLL）［7］、B 細胞急性淋巴細胞白血?。ˋcute Lymphoblastic Leukemia，ALL）［8］患者中低表達，在 T 細胞 ALL 患者［9］、兒童ALL患者中［10］高表達。miR-196b可調(diào)節(jié)造血功能，并隨時間推移表達逐漸下降［11］。miR-196b在慢性粒細胞白血?。–hronic Myeloid Leukemia，CML）中的研究很少，因此本研究通過構(gòu)建miR-196過表達載體，并在K562細胞內(nèi)進行驗證，為研究其對慢粒發(fā)生發(fā)展的調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人骨髓樣本（南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院提供），與受試者簽署知情同意書并獲得南方醫(yī)院倫理委員會批準書;質(zhì)粒 plVTHM、psPAX2、pMD2.G（南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院張寶副教授惠贈）;K562細胞（廣東省人民醫(yī)院中心實驗室提供）;293T細胞（南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所提供）;大腸桿菌 DH5α（Escherichia coli，E.coli）由本室保存。

Ficoll淋巴細胞分離液（GE公司）;QIAamp?DNA Mini and Blood Mini Kit和QIAGEN Plasmid Midi Kit（Qiagen公司）;EX Taq DNA聚合酶和SYBR Premix Ex TaqⅡ（大連寶生物工程公司）;限制性內(nèi)切酶和 T4 DNA連接酶（New England Biolabs公司）;Wizard? SV瓊脂糖膠和PCR產(chǎn)物純化系統(tǒng)（Promega公司）;胎牛血清（Gibco公司）;轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000（Invitrogen公司）;Hairpin-itTMmicroRNA qPCR Quantitation Kit（上海吉瑪公司）;引物合成及測序由Invitrogen（廣州）公司完成;Cell Counting Kit（CCK-8）（DOJINDO公司）。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建慢病毒表達載體plVTHM-miR-196b:查詢miRBase數(shù)據(jù)庫獲得miR-196b前體pre-miR-196b序列為:5'-ACUGGUCGGUGAUUUAGGUAGUU UCCUGUUGUUGGGAUCCACCUUUCUCUCGACAGC ACGACACUGCCUUCAUUACUUCAGUUG-3'，在其上下游各添加100 bp的側(cè)翼序列，采用Primer5.0設(shè)計引物。上游引物P1序列為:端引入ClaⅠ和MluⅠ的酶切位點，下劃線部分為酶切位點。采用Ficoll法分離正常人骨髓細胞，提取基因組DNA作為模板，擴增pre-miR-196b，反應(yīng)條件為:94 ℃，3 min;94 ℃，30 s，50 ℃，30 s，72 ℃，30 s共30循環(huán);72℃，7 min。PCR產(chǎn)物切膠回收后和載體plVTHM分別用ClaⅠ和MluⅠ進行雙酶切，酶切片段連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，在Amp抗性篩選平板上挑取單菌落擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，對質(zhì)粒進行酶切鑒定并測序。

1.2.2 包裝慢病毒顆粒:接種293T細胞到10 cm培養(yǎng)皿中，采用 Lipofectamine 2000，共轉(zhuǎn)染 20 μg plVTHM-miR-196b、15 μg psPAX2 和 6 g pMD2.G。轉(zhuǎn)染48 h后，4℃，1 000×g離心10 min取病毒上清，并用0.45 μm濾器過濾，分裝至1.5 mL離心管，－80℃保存病毒液。

1.2.3 病毒滴度測定:接種K562細胞到96孔板中，加入不同濃度的病毒液進行感染。設(shè)5個病毒濃度梯度組，每組加入不同量病毒液，分別為40、80、160、320 和 640 μL，設(shè) 2 個對照組，1 組加入終濃度5 mg/L的polybrene，1組為陰性對照。培養(yǎng)72 h后，用倒置顯微鏡觀察并紀錄每個濃度梯度中綠色熒光蛋白陽性的細胞數(shù)。根據(jù)病毒上清液體積、稀釋倍數(shù)、綠色熒光蛋白陽性細胞數(shù)，計算出病毒上清液的滴度:滴度={（%綠色熒光蛋白陽性細胞數(shù)〕×（第2天細胞數(shù)/mL）}/病毒量（mL）。每組設(shè)3個復(fù)孔，結(jié)果取平均值。

1.2.4 感染并分選綠色熒光蛋白陽性細胞:接種K562細胞到6孔板中，加入病毒液感染。24 h后，移去病毒上清稀釋液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，收集感染的細胞，用流式細胞儀分選綠色熒光蛋白陽性細胞，擴大培養(yǎng)。

1.2.5 熒光定量PCR檢測細胞內(nèi)miR-196b的表達:采用Hairpin-itTMmicroRNA qPCR Quantitation Kit檢測miR-196b的表達，Q-miR-196b上下游引物混合物P3為:5'-GCAGCACGCTAGGTAGTTTCCTATCG TTGTTCTCCACTCCTTGAC-3'，內(nèi)參 Q-U6上下游引物混合物P4為:5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGA TTGGAACGCTTCACGAATTTG-3'，PCR反應(yīng)條件為:95 ℃，3 min;95 ℃，12 s，62 ℃，40 s，共40 循環(huán)。

1.2.6 細胞增殖檢測:采用CCK-8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒檢測細胞的增殖水平，在96孔板接種K562細胞、plv空病毒細胞、過表達miR-196b細胞，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h后，在450 nm測定吸光度。每個樣品設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒表達載體plVTHM-miR-196b的構(gòu)建及鑒定

pre-miR-196b的PCR擴增產(chǎn)物大小預(yù)計為284 bp（圖1），結(jié)果與預(yù)期一致。提取的質(zhì)粒酶切鑒定正確后（圖2），進行測序。選擇測序正確的重組質(zhì)粒進行下一步實驗，操作結(jié)果如下:

2.2 包裝病毒，滴度測定，分選綠色熒光蛋白陽性細胞

由plVTHM-miR-196b包裝的病毒命名為196b病毒，由plVTHM包裝的病毒命名為plv病毒。病毒滴度測定為6×106TU/mL。不同濃度病毒液感染K562細胞的效率不同（圖3），最后選擇用160 μL病毒液/1 mL培養(yǎng)基感染細胞。感染后的細胞用流式細胞儀分選綠色熒光蛋白陽性細胞，并擴大培養(yǎng)，把196b病毒感染的細胞命名為過表達miR-196b細胞，把plv病毒感染的細胞命名為plv空病毒細胞。

圖1 pre-miR-196b的擴增序列Fig 1 Pre-miR-196b amplification products

圖2 plVTHM-miR-196b酶切結(jié)果Fig 2 plVTHM-miR-196b digestion results

2.3 熒光定量PCR檢測細胞內(nèi)miR-196b的表達水平

plv空病毒細胞和K562細胞中miR-196b的表達水平很低且基本一致，miR-196b細胞中miR-196b的表達水平明顯高于其他兩組（P＜0.05）（圖4）。

2.4 細胞增殖檢測

K562細胞增殖 ＞plv空病毒細胞 ＞過表達miR-196b細胞（表1，圖5），過表達 miR-196b細胞的增殖顯著慢于K562細胞和plv細胞（P＜0.05）。

3 討論

對于懸浮細胞K562來說，可采用普通分化細胞常用的轉(zhuǎn)染方法，如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后抗生素篩選，但該方法時間長、效率低;也可使用電穿孔的方法，雖然效率高但對細胞損傷比較大。慢病毒載體系統(tǒng)具有對細胞毒性小、轉(zhuǎn)染效率高、可長期穩(wěn)定表達等特點，因此我們選擇慢病毒載體系統(tǒng)，成功構(gòu)建了miR-196b慢病毒表達載體，并進行病毒包裝和細胞感染，對感染的細胞檢測了miR-196b的表達水平，結(jié)果表明miR-196b在慢粒細胞K562中成功穩(wěn)定表達。

圖3 不同濃度病毒感染K562結(jié)果Fig 3 Different concentrations of virus infection of K562（×10）

圖4 不同細胞中miR-196b的表達水平Fig 4 miR-196b expression levels in different cells

表1 CCK-8法檢測不同細胞增殖的結(jié)果Table 1 The detection of different cells proliferation by CCK-8（±s，n=3）

表1 CCK-8法檢測不同細胞增殖的結(jié)果Table 1 The detection of different cells proliferation by CCK-8（±s，n=3）

*P ＜0.05 compared with K562;#P＜0.05 compared with plv.

day K562 cells plv cells cells overexpressed miR-196b 1 1.590±0.14 1.141±0.19 0.992±0.18 2 2.747±0.20 2.211±0.249 1.712±0.1864*3 5.214±0.19 4.086±0.155 3.101±0.117*#4 5.536±0.182 3.944±0.209 3.140±0.1419*#

圖5 CCK-8法檢測不同細胞的增殖結(jié)果Fig 5 The detection of different cells proliferation by CCK-8

我們又進一步檢測了不同細胞的增殖情況，結(jié)果表明K562細胞穩(wěn)定過表達miR-196b后，增殖水平顯著下降，提示miR-196b有抑制K562細胞增殖的作用。miR-196b的其他研究表明，miR-196b在不同的腫瘤細胞中對細胞增殖的作用不同。Suman Bhatia等［8］的研究表明在B細胞急性淋巴細胞白血病細胞EB-3中miR-196b有抑制細胞增殖、促進凋亡的作用;How C等［12］研究表明，在子宮頸癌細胞中過表達miR-196b可以抑制腫瘤細胞的增殖、集落生成，遷移和侵襲;有研究表明［13］，miR-196b可以抑制異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞的增殖、促進凋亡。還有研究表明［14］在胃癌細胞中 miR-196b有促進細胞增殖、提高生存率的作用;研究表明［15］miR-196b可以促進成膠質(zhì)細胞瘤的增殖，并導(dǎo)致不良預(yù)后。因此各細胞系中miR-196b對增殖的作用并不相同，miR-196b在K562中的抑制增殖作用還需進一步研究。

總之，上述結(jié)果為今后研究miR-196b在慢粒中的作用機制和功能提供了依據(jù)。

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