新生小鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)及形態(tài)學觀察的優(yōu)化方法＊

常 翔，方淑環(huán)，張 玉，閆 蓉，屈 趙，侯雪芹，蘇如玉，張 磊，楊 從，王 奇

（廣州中醫(yī)藥大學臨床藥理研究所，廣州510405）

海馬在認知、學習和記憶等方面都扮演著極為重要的角色［1］，是阿爾茨海默?。ˋlzhei mer′s disease，AD）的主要病變部位，利用海馬神經(jīng)元建立一個直觀的體外研究的神經(jīng)元活動的實驗模型，對阿爾茨海默病等神經(jīng)性疾病的研究有著極大的價值。關(guān)于神經(jīng)突觸的研究方面，樹突棘的形態(tài)學觀察具有很重要的價值，綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）對神經(jīng)元進行轉(zhuǎn)染后能夠清晰觀察到單個神經(jīng)元軸突、樹突、樹突棘等，但這一方法對神經(jīng)元狀態(tài)及轉(zhuǎn)染效率的控制要求較高，而一般胎鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)以及利用脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染較難達到這一要求。本文在文獻基礎(chǔ)上［2-7］進行改進優(yōu)化，培養(yǎng)出具有良好形態(tài)的小鼠海馬神經(jīng)元，并用適當方法轉(zhuǎn)染，得到單個神經(jīng)元和樹突棘形態(tài)特征清晰的顯像，為神經(jīng)突觸研究提供基礎(chǔ)，現(xiàn)將方法報道如下。

1 材料與方法

1．1 材料 新生小鼠（P0），由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供；DMEM、F12、B27、HBSS、FBS、Neurobasal medium培養(yǎng)基、丙酮酸鈉等均購自Gibico公司，多聚賴氨酸、DNAse購自Sig ma公司，24孔培養(yǎng)板（COSMO）由廣州友田生物科技有限公司提供。

1．2 原代細胞培養(yǎng)

1．2．1 培養(yǎng)板的處理 24孔板中每孔加入30μg／mL的多聚賴氨350μL，37℃培養(yǎng)箱中過夜，滅菌水洗3次，晾干，封口膠封邊，4℃保存。使用前于每孔中加入500μL的DMEM潤洗，放入37℃培養(yǎng)箱中備用。

1．2．2 試劑配制 解剖液成分：HBSS 49 mL，1 M葡萄糖500μL，雙抗（青霉素／鏈霉素）500μL，置于冰上備用。消化液成分：HBSS 2．5 mL，0．25%胰酶2．5 mL。重懸液成分：F12 2．5 mL，DMEM 2．5 mL，雙抗2．5 mL，DNAse 5μL。培養(yǎng)液成分：神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基47．5 mL，丙酮酸鈉500μL，雙抗500 μL，L-谷氨酰胺500μL，B27 1 mL。消化液及培養(yǎng)液放入37℃水浴箱中預熱。

1．2．3 培養(yǎng)方法 用70%乙醇消毒超凈臺及使用器械，超凈臺上鋪手術(shù)巾，打開紫外燈照射40 min。打開解剖顯微鏡，取1個60 mm培養(yǎng)皿倒入解剖液，置于解剖顯微鏡下。取新生小鼠（P0）置于手術(shù)巾上，70%乙醇消毒，斷頭處死，剪開頭皮及顱骨，取出全腦，放入解剖液中，于解剖顯微鏡下剔除腦膜和血管，剝離出海馬組織，移入裝有解剖液的15 mL離心管中置于冰上。以上解剖應在1 h內(nèi)完成。用冰解剖液將海馬洗3次，棄去解剖液，加入0．125%的低濃度胰酶于37℃水浴箱中消化20 min，其間每隔4～5 min充分晃動離心管以促進消化。消化結(jié)束后加入10%體積分數(shù)的胎牛血清終止消化。以2 000 r／min離心5 min后棄上清液，加入重懸液重懸細胞，用火焰拋光的巴斯德滴管吹打數(shù)次，充分分離神經(jīng)元，用細胞篩過濾細胞至一新的離心管中，加入10%體積分數(shù)的胎牛血清后以2 000 r／min離心5 min，棄去上清液，加入培養(yǎng)液重懸細胞，充分吹打混勻，進行細胞計數(shù)，以每孔8×104個細胞接種于24孔板中，置于37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔3～4 d更換1／4培養(yǎng)基。選取不同時間點在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1．3 GFP轉(zhuǎn)染 GFP在細胞和分子生物學中通常被用來作為一個報告基團［8］，在藍光照射下可以發(fā)出明亮的綠色熒光。培養(yǎng)至第17天的細胞采用磷酸鈣共沉淀法［9］，配制CaCl2-DNA-磷酸緩沖液的復合物，進行GFP質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后固定細胞，于熒光顯微鏡下進行形態(tài)學觀察。

2 結(jié) 果

在倒置顯微鏡下觀察，細胞接種后為透亮圓形較小的細胞，12 h后完全貼壁，長出短小的突起；3～4 d后突起逐漸增長增多，形成稀疏的網(wǎng)絡(luò)，此時神經(jīng)元胞體多為橢圓形或三角形；5～7 d神經(jīng)元胞體逐漸增大，突起增粗，細胞間形成網(wǎng)絡(luò)，細胞體核突起明顯，立體感增強（圖1）。第17天進行GFP轉(zhuǎn)染，48 h后固定細胞于熒光顯微鏡下觀察，胞體進一步增大，呈橢圓形，可以清楚觀察到從胞體伸出的軸突和多條樹突，樹突棘明顯（圖2～4），為典型的海馬神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)特征。

圖1 培養(yǎng)7 d的海馬神經(jīng)元細胞（普通光學顯微鏡×400）

圖2 培養(yǎng)17 d轉(zhuǎn)染GFP后的神經(jīng)元細胞（熒光顯微鏡×400）

圖3 培養(yǎng)17 d的海馬神經(jīng)元樹突及樹突棘明顯增多（熒光顯微鏡×600）

圖4 轉(zhuǎn)染GFP后的樹突及樹突棘（熒光顯微鏡×600）

3 討 論

在阿爾茨海默病的研究中，神經(jīng)元是研究的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，神經(jīng)突觸是研究的重要方面。海馬是神經(jīng)元比較集中的組織，非神經(jīng)元細胞在此處較少，故在進行神經(jīng)元的原代培養(yǎng)時首選海馬組織。傳統(tǒng)方法多用胎鼠進行原代海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)，但是胎鼠的胎齡不易掌握，海馬剝離困難，且某些核團和功能區(qū)的解剖部位不易準確定位［10］，而新生小鼠的海馬易于剝離，且神經(jīng)元分化程度較高，神經(jīng)突起發(fā)育成熟，故新生鼠是更好的選擇［11-12］。另外，在進行神經(jīng)突觸研究時，樹突棘的形態(tài)學觀察和計數(shù)是一個重要方面，因此，對于單個神經(jīng)元的清晰顯像就顯得尤為重要，本實驗所應用的磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染GFP不失為一種理想的選擇。

在海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)中，對于實驗條件的要求較為苛刻，因此，在實驗中要尤其注意取材及組織消化過程、培養(yǎng)基成分、細胞接種數(shù)量等問題。首先，新生小鼠的海馬外包裹有一層血管膜，在取材過程中一定要注意將這層血管膜清除干凈，否則血管膜的一部分成纖維細胞會混入原代培養(yǎng)中，這些細胞會大量分裂，導致實驗失敗。其次，新生小鼠的神經(jīng)元之間以及神經(jīng)元與纖維組織之間結(jié)合比較緊密，消化分離的過程容易造成損傷，因此，消化分離過程中一般使用0．125%的低濃度胰酶，其間動作要輕柔，消化時間不宜過長，控制在20 min內(nèi)，并輕柔均勻振搖分散組織，盡可能減少消化分離過程中造成的機械和化學損傷。第三，在神經(jīng)元的培養(yǎng)中，培養(yǎng)基是實驗成功的關(guān)鍵因素之一，在本實驗中使用B27代替血清配置無血清培養(yǎng)基，相對于血清而言，B27成分清楚，含有多種細胞生長的必要因子，是較為理想的添加劑。采用B27無血清培養(yǎng)基可以選擇性地使神經(jīng)元生長，而抑制非神經(jīng)元細胞的生長和增殖［13］，能夠起到純化神經(jīng)元的作用。此外，該培養(yǎng)基含有多種抗氧化劑，能夠保持神經(jīng)元的活性［14］。最后，種板密度也是實驗中重要一環(huán)，在神經(jīng)突觸研究中對樹突棘的形態(tài)學觀察常需要以單個神經(jīng)元作為觀察對象，故種板密度不宜過高，當然，種板密度過低，神經(jīng)元不能相互接觸，也會導致神經(jīng)元難以存活或者成熟。因此，通常需要在預實驗中接種不同密度細胞觀察獲得合適的細胞密度。另外，在本實驗中未應用阿糖胞苷等抑制細胞有絲分裂的藥物來抑制膠質(zhì)細胞的生長，因阿糖胞苷的用量較難控制，劑量過小則不能起到抑制膠質(zhì)細胞增殖的作用，而劑量過大會對神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用，影響神經(jīng)元活性［15］。

在本實驗中應用的GFP是一種不需要任何外源反應底物，只需要藍光照射就可以發(fā)出熒光的一種蛋白，常被用來進行活細胞標記。由于GFP對神經(jīng)元僅有極小的毒性作用，因此，在神經(jīng)生物學研究中常被用來作為報告基團［16］。本實驗用e GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)17～19 d的小鼠海馬神經(jīng)元細胞，采用了傳統(tǒng)的磷酸鈣共沉淀法進行轉(zhuǎn)染，相較于常用的脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染，前者更適合于做神經(jīng)元細胞爬片的轉(zhuǎn)染［7］，并且磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染效率較低，對于以單個神經(jīng)元為觀察對象的神經(jīng)突觸的形態(tài)學方面的研究，該方法顯得更為優(yōu)越。本實驗中，轉(zhuǎn)染48 h后在熒光顯微鏡下進行形態(tài)學觀察，結(jié)果顯示神經(jīng)元胞體飽滿、細胞突起豐富，神經(jīng)元細胞處于最佳狀態(tài)，軸突、樹突及樹突棘顯像清晰。磷酸鈣共沉淀法對小鼠海馬神經(jīng)元進行GFP轉(zhuǎn)染效果良好。

綜上所述，在阿爾茨海默病的研究中，選用最優(yōu)化的方法培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細胞是研究的基礎(chǔ)，而用GFP標記單個神經(jīng)元在神經(jīng)突觸的形態(tài)學［9］及電生理［17］等研究中都極為重要。本文中所采用的神經(jīng)元培養(yǎng)方法及GFP轉(zhuǎn)染方法具有極大優(yōu)越性，可進行推廣使用。

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