si RNA沉默ST MN1對(duì)食管癌Eca-109細(xì)胞紫杉醇敏感性的影響＊

朱鴻武，江 丹，謝子英，周梅花，孫大勇，趙亞剛

（廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院消化內(nèi)科，廣州510010）

食管癌是最為常見(jiàn)的腫瘤之一，在世界腫瘤疾病導(dǎo)致的死亡原因中位居第六［1］。中國(guó)是食管癌死亡率最高的國(guó)家之一，食管癌在中國(guó)癌癥所致的死亡原因中位居第四［2］。有研究報(bào)道，食管癌患者即使在嚴(yán)格的病例選擇和術(shù)前予以新輔助化療，聯(lián)合手術(shù)根除性治療后預(yù)后仍較差，5年存活率僅在20%左右［3］。因此，提高食管癌放化療有效性、通過(guò)多模態(tài)治療提高患者生存期和改善生存質(zhì)量成為近年食管癌的研究熱點(diǎn)。導(dǎo)致化療失敗的一個(gè)最主要的原因就是食管癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的原發(fā)性或繼發(fā)性耐藥。但是，目前食管癌的耐藥機(jī)制尚不清楚。因此，進(jìn)一步研究并闡明食管癌的耐藥機(jī)制有助于為臨床提高食管癌患者的治療預(yù)后提供重要的理論依據(jù)。

紫杉醇是從美國(guó)短葉紅豆杉的樹(shù)皮中提取而來(lái)的一種物質(zhì)，因其可以促進(jìn)微管聚合，抑制微管降解，使細(xì)胞分裂周期阻滯在G2／M期，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡，因而具有很強(qiáng)的抗腫瘤作用，目前已被應(yīng)用于包括食管癌在內(nèi)的多種腫瘤化療之中［4］。但是，隨著臨床應(yīng)用的增多，對(duì)紫杉醇耐藥的現(xiàn)象也在逐漸增多［4］。ST MN1是一種能夠在細(xì)胞的有絲分裂期和分裂間期改變微管動(dòng)力學(xué)的微管脫穩(wěn)定化磷蛋白［5］，在許多人類癌組織中表達(dá)增加，參與了細(xì)胞增殖、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、微管動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)和周期調(diào)節(jié)等功能［5］。近年來(lái)，有報(bào)道稱ST MN1在乳腺癌和骨肉瘤對(duì)紫杉醇的耐藥中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用［6-8］，提示STMN1也是一個(gè)耐藥相關(guān)基因。ST MN1是否在食管癌對(duì)紫杉醇的耐藥中具有促進(jìn)作用呢？目前尚無(wú)研究報(bào)道。本研究使用小干擾RNA（si RNA）在食管癌Eca-109細(xì)胞中沉默STMN1的表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)藥敏和凋亡等實(shí)驗(yàn)觀察干預(yù)前、后食管癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性變化，初步探索沉默ST MN1對(duì)食管癌細(xì)胞紫杉醇敏感性的影響。

1 材料與方法

1．1 材料 人食管癌Eca-109細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；Trizol、LipofectamineTM2000和Opti-MEM?I購(gòu)自Invertrogen公司；RIPA裂解液、5 X蛋白上樣緩沖液、十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒、PMSF、麗春紅染色液、MTT和結(jié)晶紫購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；NC膜和ECL購(gòu)自Millipore公司；RPMI-1640培養(yǎng)基和Hyclone胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；紫杉醇購(gòu)自美國(guó)施貴寶公司；Hoechst染色試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；STMN1 si RNA和scramble si RNA購(gòu)自上海吉瑪制藥公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購(gòu)自寶生物（大連）公司。anti-ST MN1一抗（＃3352）購(gòu)自Cell Signaling公司；anti-β-actin一抗（sc-47778）購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗小鼠二抗購(gòu)自中杉金橋公司。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 細(xì)胞培養(yǎng) Eca-109細(xì)胞所用培養(yǎng)液為添加有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，除用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)前1周開(kāi)始不使用抗菌藥物以外，所有培養(yǎng)液中已加入青霉素／鏈霉素。細(xì)胞培養(yǎng)于含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。所有用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1．2．2 相關(guān)引物序列和q PCR 使用pub med BLAST工具和查閱文獻(xiàn)設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)的引物，ST MN1上游引物：5′-TAC ACT GCC TGT CGC TTG TC-3′，下 游 引 物：5′-GGG GAA AGG GGG AAT TCT GG-3′；GAPDH［9］：上 游 引 物5′-CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT-3′，下游引物：5′-AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC-3′。采用Trizol氯仿法提取RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，按照實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系并進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。

1．2．3 相關(guān)si RNA序列及轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 根據(jù)文獻(xiàn)［7］合成STMN1 si RNA，正義鏈：5′-GAA ACG AGA GCA CGA GAA A-3′，反 義 鏈：5′-UUU CUC GUG CUC UCG UUU C-3′；無(wú) 關(guān)si RNA，正義鏈：5′-GCA AAA GAG CGA AAA G-3′，反義鏈：5′-CUU UUC GCU CUU UUG C-3′。按LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染步驟，轉(zhuǎn)染6 h以后更換培養(yǎng)液，72 h以后收取細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。

1．2．4 Wester n blot實(shí)驗(yàn) 胰酶消化并收集細(xì)胞，裂解液裂解并提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜并進(jìn)行裁剪，用含5%脫脂牛奶的PBST封閉，一抗4℃孵育過(guò)夜；洗膜，二抗室溫孵育1 h；洗膜后加ECL溶液顯影觀察。

1．2．5 MTT藥敏實(shí)驗(yàn) 胰酶消化收集細(xì)胞，按5×103／孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔培養(yǎng)液200μL，待細(xì)胞貼壁16 h；加入適當(dāng)濃度梯度的紫杉醇進(jìn)行體外藥物敏感性檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔、對(duì)照孔，培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育72 h；72 h以后先后加入MTT溶液和二甲基亞砜（DMSO），用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度并進(jìn)行分析。

1．2．6 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 胰酶消化收集細(xì)胞，按1×103／孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁16 h后；加入0．04μmol／L的紫杉醇進(jìn)行體外藥物敏感性檢測(cè)，每3 d更換培養(yǎng)液1次，共計(jì)培養(yǎng)14 d；14 d后，棄培養(yǎng)液，清洗、固定，0．5%結(jié)晶紫染色，數(shù)碼相機(jī)拍照后用Photoshop CS3軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1．2．7 Hoechst 33258核染色實(shí)驗(yàn) 胰酶消化收集細(xì)胞，按1×106／孔的密度接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁16 h；加入0．1 μmol／L的紫杉醇，培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育36 h誘導(dǎo)凋亡；36 h以后，按Hoechst試劑盒說(shuō)明書(shū)染色、封片，用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16．0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 轉(zhuǎn)染ST MN1 si RNA前、后Eca-109細(xì)胞ST MN1表達(dá)水平的變化 q PCR和Wester n blot檢測(cè)結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染STMN1 si RNA 72 h以后，食管癌Eca-109細(xì)胞中的ST MN1的mRNA表達(dá)水平（圖1）和蛋白水平（圖2）均明顯下降。

圖1 轉(zhuǎn)染si RNA前、后食管癌Eca-109細(xì)胞中ST MN1 mRNA的表達(dá)變化（GAPDH作為內(nèi)參基因）

圖2 轉(zhuǎn)染si RNA前、后食管癌Eca-109細(xì)胞中ST MN1蛋白的表達(dá)變化（β-actin作為內(nèi)參）

2．2 MTT藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示沉默ST MN1可增加紫杉醇對(duì)Eca-109細(xì)胞的抑制率 MTT藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用特異性si RNA沉默ST MN1的表達(dá)后，食管癌Eca-109細(xì)胞相對(duì)于非特異si RNA轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞，對(duì)紫杉醇的IC50值明顯下降（P＜0．01），提示對(duì)藥物敏感性增加（圖3）。

圖3 沉默ST MN1后Eca-109細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性

2．3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示沉默ST MN1可增加Eca-109細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用特異性si RNA沉默ST MN1的表達(dá)后，食管癌Eca-109細(xì)胞在0．04μmol／L紫杉醇的作用下平板克隆數(shù)目與非特異si RNA轉(zhuǎn)染組比較有明顯減少，見(jiàn)圖4。

圖4 沉默ST MN1后食管癌Eca-109細(xì)胞紫杉醇作用下克隆形成數(shù)目

2．4 沉默ST MN1后Eca-109在紫杉醇作用下凋亡增加 與空白對(duì)照組和無(wú)關(guān)si RNA轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染了ST MN1特異性si RNA的Eca-109細(xì)胞在0．1μmol／L紫杉醇作用36 h以后，Hoechst 33258染料核染色顯示核濃染和碎裂的細(xì)胞明顯增多（圖5），提示凋亡細(xì)胞數(shù)目增加。

圖5 沉默ST MN1后食管癌Eca-109細(xì)胞在紫杉醇作用下凋亡增加（×400）

3 討 論

紫杉醇為紫杉烷類代表性的一種物質(zhì)，目前已被廣泛應(yīng)用于食管癌等多種惡性腫瘤的化療方案之中［4，10］。但是，紫杉醇也具有較強(qiáng)的不良反應(yīng)，如過(guò)敏反應(yīng)、脫發(fā)、骨髓抑制和周?chē)窠?jīng)病等［11］，一定程度上影響了該藥的使用。近年來(lái)，紫杉醇在腫瘤治療中的原發(fā)性和繼發(fā)性耐藥問(wèn)題逐漸受到重視。如何降低紫杉醇耐藥的發(fā)生，甚至在降低該藥的使用濃度亦能同樣達(dá)到有效殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，對(duì)臨床食管癌患者的治療具有重要的意義。

ST MN1也被稱作stathmin 1、腫瘤蛋白18、metablasin、p18或p19，它由位于人染色體1p36．1的ST MN1基因編碼，是一種能夠在細(xì)胞有絲分裂期和分裂間期改變微管動(dòng)力學(xué)的微管脫穩(wěn)定化磷蛋白［5］。ST MN1在細(xì)胞正常生理中參與了有絲分裂中微管的調(diào)節(jié)，但是，在腫瘤細(xì)胞中常常發(fā)生因?yàn)镾T MN1失調(diào)而導(dǎo)致有絲分裂紡錘體功能減退和導(dǎo)致對(duì)紫杉醇的耐藥［12］。近年來(lái)亦有研究報(bào)道ST MN1可促進(jìn)乳腺癌和骨肉瘤對(duì)紫杉醇的耐藥［6-8］。因此，推測(cè)ST MN1很可能也參與了食管癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥。

本研究通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將ST MN1 si RNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入食管癌Eca-109細(xì)胞中，q PCR和Wester n blot提示基因干擾效果確切，轉(zhuǎn)染后ST MN1無(wú)論是mRNA水平還是蛋白水平均有明顯下降。進(jìn)一步在細(xì)胞藥敏實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，沉默ST MN1的表達(dá)后食管癌Eca-109細(xì)胞對(duì)紫杉醇的化療敏感性明顯增強(qiáng)。由此推測(cè)，在有效沉默ST MN1的表達(dá)后，即使降低紫杉醇的藥物濃度亦可以同樣有效地殺傷食管腫瘤細(xì)胞，因此有助于臨床中降低化療藥物用量，減少不良反應(yīng)的發(fā)生和提高治療有效性。在細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)沉默ST MN1的表達(dá)后，食管癌Eca-109細(xì)胞在紫杉醇作用下凋亡也明顯增加，提示ST MN1導(dǎo)致的耐藥機(jī)制之一可能為減少食管癌細(xì)胞在紫杉醇作用下的凋亡。

綜上所述，ST MN1在食管癌對(duì)紫杉醇的化療敏感性中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，通過(guò)si RNA有效沉默ST MN1的表達(dá)有助于增強(qiáng)食管癌對(duì)紫杉醇化療的敏感性并導(dǎo)致食管癌細(xì)胞化療下凋亡的增加。本研究結(jié)果有助于進(jìn)一步闡明食管癌對(duì)紫杉醇耐藥的機(jī)制，亦可能有助于為臨床中減少紫杉醇類藥物不良反應(yīng)和降低化療耐藥的發(fā)生提供理論依據(jù)。

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