白花蛇舌草對人骨肉瘤MG-63細(xì)胞Bax基因表達(dá)的影響＊

黃煜朗，唐毓金，△，王俊利，謝克恭，黃 可

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，南寧530021；2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院脊柱骨病外科，廣西百色；3.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西百色533000）

骨肉瘤是兒童與青少年常見的起源于間葉組織的惡性腫瘤。隨著化學(xué)治療、手術(shù)及骨重建等治療手段的發(fā)展，有資料研究顯示目前5年總體生存率為55%～75%［1-2］，但仍是病死率極高的惡性腫瘤。因此，研究新的抗腫瘤藥并應(yīng)用于臨床是提高骨肉瘤療效的重要途徑之一。本試驗(yàn)通過測定白花蛇舌草注射液對骨肉瘤MG-63 細(xì)胞Bax 基因表達(dá)的影響，為進(jìn)一步開發(fā)白花蛇舌草抗骨肉瘤的藥用價值奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63 細(xì)胞為廣西醫(yī)科大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心惠贈，引自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.1.2 藥物與試劑 白花蛇舌草注射液購自安徽鳳陽科苑藥業(yè)有限公司（國藥準(zhǔn)字號Z34020595，批號120601）；MTT、二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司。胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基購自Gibico 上海立菲生物技術(shù)有限公司；PBS（1 ×）、胰蛋白酶購自北京索萊寶公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96 孔板、15 m L 離心管購自Corning 公司；TRIzol 試劑購自Invitrogen公司；引物合成由寶生物工程（大連）有限公司完成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa 公司；MarkerⅠ、2 ×Taq PCR Master Mix（KT201-01）、SYBR GreenⅠ試劑盒購自TianGen 公司；8 聯(lián)管購自美國Axygen 公司。

1.1.3 儀器CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱MCO-18AIC、超低溫冰箱MDF-U72V購自日本SANYO公司；生物安全柜BHC-1300ⅡA／B3 購自蘇凈集團(tuán)安泰公司；電熱恒溫水槽DK-8D 型購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；臺式離心機(jī)購自上海安亭科學(xué)儀器廠；酶標(biāo)儀（Multiskan MK3 Thermo），PCR儀（BIO-RAD），倒置顯微鏡（Leica 型號DMIL）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人骨肉瘤MG-63 細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，加入體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（以下簡稱培養(yǎng)基）5 m L，置于5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2 d傳代1 次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制 取對數(shù)生長期的細(xì)胞用0.25%胰酶消化后加培養(yǎng)基5 m L吹打成混懸液，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度，取150μL（5 ×103個）接種于96 孔板。將白花蛇舌草注射液與培養(yǎng)基配制成50、100、200、300、400μL／m L不同濃度含藥液，現(xiàn)配現(xiàn)用。待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，加入不同濃度的含藥液，并設(shè)空白對照組（只加相同量培養(yǎng)基），每組5個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h 后，加入20μL的5 mg／mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄去含藥液，加入150μL DMSO，37 ℃恒溫?fù)u床震蕩10 min，待結(jié)晶完全溶解后，在酶標(biāo)儀上492 nm波長測定吸光度（A）值，取平均值，計(jì)算細(xì)胞抑制率。計(jì)算公式：細(xì)胞增殖抑制率（RI）＝（對照組A值-藥物組A值）／對照組A值×100%。

1.2.3 Bax 基因表達(dá)

1.2.3.1 總RNA提取 取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整為1 ×105個／mL，接種于培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞貼壁后加100μL／mL含藥培養(yǎng)基5 m L，分別培養(yǎng)6、12、24、48 h，按照Trizol 提取試劑說明書進(jìn)行總RNA提取。紫外分光光度計(jì)測定總RNA濃度，取A260／A280在1.80～2.20 之間用于RT-PCR。

1.2.3.2 cDNA合成 參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明SYBR Premix Ex Taq TMⅡ（RR820A），將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.3.3 RT-PCR檢測 參照PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time）（RR047A）試劑盒說明。25.0μL 反應(yīng)體系包括SYBR Permix Ex TaqⅡ12.5μL，上下游目的及內(nèi)參（β-actin）引物（表1）各0.5μL，cDNA 1.0 μL，dd H2O 10.5μL。將25.0μL體系設(shè)3 個復(fù)孔，加入8 聯(lián)管中，使用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，95℃變性30s，95℃PCR反應(yīng)5 s、63 ℃退火30 s，共計(jì)40 個循環(huán)的PCR反應(yīng)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。反應(yīng)結(jié)束后得到擴(kuò)增曲線和溶解曲線，計(jì)算2-△△Ct值。

表1 RT-PCR 引物

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 白花蛇舌草注射液對MG-63 細(xì)胞增殖抑制作用MTT法檢測結(jié)果示：（1）白花蛇舌草注射液對MG-63 細(xì)胞的抑制作用呈濃度依賴，當(dāng)白花蛇舌草注射液濃度為200μL／m L、作用24 h 可見絕大部分細(xì)胞變圓、脫落、死亡。濃度在50μL／mL時抑制作用不明顯（P＞0.05），而濃度為100μL／m L 時有明顯的抑制作用（P＜0.05）。取濃度為100μL／m L進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，見表2。（2）倒置顯微鏡下觀察濃度為100μL／m L白花蛇舌草注射液對MG-63 細(xì)胞不同作用時間的細(xì)胞形態(tài)。空白對照組細(xì)胞狹長、形態(tài)多樣，較緊密地貼壁生長，加藥組（加藥6 h組、12 h 組、24h 組及48h 組）細(xì)胞隨著藥物作用時間的延長，細(xì)胞逐漸皺縮、細(xì)胞間間隔變大，增殖被抑制，見圖1。

2.2 Bax 基因的表達(dá)水平 RT-PCR 檢測結(jié)果顯示，Bax 基因溶解曲線無非特異擴(kuò)增和引物二聚體，見單一峰，無雜峰，結(jié)果可信，見圖2。取100μL／m L白花蛇舌草注射液分別作用于MG-63 細(xì)胞6、12、24、48h 后，Bax 基因表達(dá)水平明顯高于空白對照組（P＜0.05），組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且呈時間依賴性，提示白花蛇舌草注射液抑制細(xì)胞增殖可能是通過上調(diào)Bax 基因表達(dá)而實(shí)現(xiàn)，見表3。

表2 不同濃度白花蛇舌草注射液對MG-63細(xì)胞的增殖抑制比較（±s）

表2 不同濃度白花蛇舌草注射液對MG-63細(xì)胞的增殖抑制比較（±s）

白花蛇舌草注射液濃度（μL／mL） 抑制率（%）005015．42±0．4310067．21±0．2720095．38±0．3130098．73±0．5640098．46±0．43

圖1 倒置顯微鏡觀察的結(jié)果（×200）

圖2 RT-PCR 檢測結(jié)果

表3 Bax基因的表達(dá)水平（±s）

表3 Bax基因的表達(dá)水平（±s）

組別 Bax基因空白對照組1．00±0．00加藥6 h 組 5．39 ±0．388加藥12 h 組 7．73 ±0．291加藥24 h 組 16．91 ±0．414加藥48 h 組23．42±0．335

3 討 論

細(xì)胞凋亡是在凋亡信號作用下，由基因調(diào)控細(xì)胞主動死亡的過程，其形態(tài)主要表現(xiàn)為細(xì)胞固縮、染色質(zhì)凝聚邊集及形成凋亡小體［3］，現(xiàn)代研究認(rèn)為腫瘤的藥物治療主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而達(dá)到治療目的［4］。Bax 基因是屬于Bcl-2 基因家族中調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)基因，表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞中，其抗腫瘤的機(jī)制是通改變線粒體膜通透性，使細(xì)胞色素C及鈣離子和小分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，激活Caspase-3，使與細(xì)胞周期及DNA修復(fù)等相關(guān)蛋白或激酶失活，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［5］。當(dāng)Bax基因過度表達(dá)則形成Bax-Bax 二聚體，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；而Bcl-2基因表達(dá)增高形成Bax-Bcl-2 二聚體時細(xì)胞凋亡被抑制，因此Bax 基因與Bcl-2 基因的比例在一定程度上決定著細(xì)胞是否凋亡［6］。中藥提取物作為抗腫瘤藥物是目前研究的熱點(diǎn)，Mousavi 等［7］研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞在濃度為200～2000μg／m L的紅花提取物中增殖受抑制，Bax 基因表達(dá)增高。Tsai 等［8］研究也表明，樟芝提取物可通過提高Bax 基因表達(dá)，降低Bc l-2 基因表達(dá)而達(dá)到誘導(dǎo)口腔癌細(xì)胞OCE-M1 和OC-2 凋亡。

白花蛇舌草屬于茜草科草本植物的全草，具有清熱解毒、活血散結(jié)、利水消腫的功效。近年來研究發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草的主要成分為蒽醌類、熊果酸、齊墩果酸、三萜類、多糖類、香豆素類及甾醇類等，具有抗菌、抗氧化、增強(qiáng)免疫功能，并通過調(diào)控Ras、C-myc、Bcl-2 等基因表達(dá)而具有不同的抗腫瘤作用［9-12］。白花蛇舌草注射液為中藥白花蛇舌草提取制成的單味藥滅菌水溶液。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)濃度為100μL／m L 的白花蛇舌草注射液作用6 h 后，倒置顯微鏡觀察可見MG-63 細(xì)胞逐漸皺縮變小、核深染，隨著時間延長，細(xì)胞變圓、懸浮死亡，與Wilde 等［13］報(bào)道一致。PCR結(jié)果顯示促凋亡的Bax 基因高表達(dá)，說明白花蛇舌草注射液對骨肉瘤MG-63 細(xì)胞具有抑制作用的機(jī)制可能是通過上調(diào)Bax 基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)立足于本地區(qū)豐富的中藥資源，對白花蛇舌草作用于骨肉瘤細(xì)胞的機(jī)制進(jìn)行部分研究，有利于白花蛇舌草的藥用開發(fā)及研制抗骨肉瘤的新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］ Jaffe N.Osteosarcoma：review of the past，impact on the future.The American experience［J］.Cancer Treat Res，2009，152：239-262.

［2］ 張清，徐萬鵬，郭衛(wèi)，等.我國骨肉瘤治療現(xiàn)狀及改進(jìn)建議——17 家骨腫瘤治療中心1998～2008年資料分析［J］.中國骨腫瘤骨病，2009，8（3）：129-132.

［3］ Tamm I，Schriever F，Dcrken B.Apoptosis：implications of basic research for clinical oncology［J］.Lancet Oncol，2001，2（1）：33-42.

［4］ Sykiotis GP，Papavassiliou AG.Apoptosis：the suicide solution in cancer treatment and chemoprevention［J］.Expert Opin Investig Drugs，2006，15（6）：575-577.

［5］ Gottlieb RA.Mitochondria and apoptosis［J］.Biol Signals Recept，2001，10（3／4）：147-161.

［6］ Claassen MA，De Knegt RJ，Tilanus HW，et al.Abundant numbers of regulatory T cells localize to the liver of chronic hepatitis C infected patients and limit the extent of fibrosis［J］.J Hepatol，2010，52（3）：315-321.

［7］ Mousavi SH，Tavakkol-Afshari J，Brook A，et al.Role of caspases and Bax protein in saffron-induced apoptosis in MCF-7 cells［J］.Food Chem Toxicol，2009，47（8）：1909-1913.

［8］ Tsai WC，Rao YK，Lin SS，et al.Methylantcinate a induces tumor specific growth inhibition in oral cancer cells via bax-mediated mitochondrial apoptotic pathway［J］.Bioorg Med Chem Lett，2010，20（20）：6145-6148.

［9］ 劉盼盼，姚曉東，李潔.白花蛇舌草化學(xué)成分及其藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國藥業(yè)，2011，20（21）：96-98.

［10］ 沈楚云，林圣云，戴鐵穎，等.白花蛇舌草誘導(dǎo)骨髓瘤8226 細(xì)胞凋亡的研究［J］.深圳中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，22（1）：4-7，65.

［11］ Wang JH，Shu LH，Yang LL，et al.2-Hydroxy-3-methylanthraquinone from Hedyotis diffusa WILLD induces apoptosis via alteration of Fas／Fas L and activation of caspase-8 in human leukemic THP-1 cells［J］.Arch Med Res，2011，42（7）：577-583.

［12］ Lin J，Wei L，Xu W，et al.Effect of hedyotis diffusa willd extract on tumor angiogenesis［J］.Mol Med Rep，2011，4（6）：1283-1288.

［13］ Wilde A，Zheng Y.Ran out of the nucleus for apoptosis［J］.Nat Cell Biol，2009，11（1）：11-12.