霍奇金淋巴瘤細(xì)胞SHP1表達(dá)與CD99表達(dá)的關(guān)系＊

雷翔慧，湯 瑤，吳自勍，趙 彤△

（1.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，廣州510515；2.南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院病理科，廣州510515）

SH2 結(jié)構(gòu)域酪氨酸磷酸化酶（SH2 domain-containing protein tyrosine phosphatase，SHP-l），主要表達(dá)于造血細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，是白血病、淋巴瘤細(xì)胞的抑癌基因，其異常表達(dá)與淋巴瘤的增殖、分化、凋亡有密切關(guān)系，表達(dá)缺失會(huì)導(dǎo)致淋巴瘤的發(fā)生［1-3］?；羝娼鹆馨土觯╤odgkin lymphoma，HL）是淋巴造血系統(tǒng)的一類腫瘤，SHP1 表達(dá)在HL 情況，尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，國(guó)外和本課題組之前研究發(fā)現(xiàn)HL的發(fā)生與CD99 蛋白表達(dá)缺失密切相關(guān)，CD99表達(dá)缺失是H L形成的一個(gè)重要分子事件［4-5］，但SHP1表達(dá)與CD99表達(dá)的關(guān)系如何，非常值得探討，為此本文在以往研究基礎(chǔ)上，檢測(cè)SHP1 在HL中的表達(dá)及其與CD99 的作用關(guān)系，探討SHP1 表達(dá)在HL中的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與細(xì)菌B 淋巴母細(xì)胞株IM9 細(xì)胞、漿母細(xì)胞株KM3 細(xì)胞、HL 細(xì)胞株L428 細(xì)胞和L428-CD99（上調(diào)CD99 的L428 細(xì)胞）細(xì)胞，由南方醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系保存。采用澳洲進(jìn)口胎牛血清（無(wú)需額外滅活），RPMI-1640 培基配制成含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基，37 ℃恒溫，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.1.2 試劑與材料RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自南美洲Gibeco 公司；蛋白裂解液RIPA、蛋白酶抑制劑PMSF和BCA-100 蛋白質(zhì)定量測(cè)定試劑盒購(gòu)自凱基公司；β-ac t in 抗體、二抗購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒購(gòu)自碧云天公司，試劑盒組成：30% AcroBis、1 mo L Tris-Hcl（p H 8.8）、10%SDS、過(guò)硫酸銨、TEMED、1 mo L Tris-Hcl（p H 6.8）；SDSPAGE 蛋白上樣緩沖液（5 ×）、蛋白預(yù)染Marker、PVDF膜、脫脂奶粉購(gòu)自廣州斯佳公司；Beyo ECL Plus 發(fā)光試劑盒購(gòu)自凱基公司。人SHP1抗體購(gòu)于美國(guó)CST公司，CD99抗體購(gòu)于Epitomic 公司。

1.2 方法

1.2.1 熒光定量PCR（RT-PCR）Trizol、RT-PCR提純?cè)噭┖?、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara 公司），7500Software v2.0.1，引物構(gòu)建于Invitrogen 公司，GAPDH上游引物：5′-ACA GTC AGC CGC ATC TTC TT-3′，下游引物：5′-GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG-3′；CD99上游引物：5′-GCC CAG CAA CAA GCA AAG CAC AT-3′，下游引物：5′-CCC AAC CAC CCT AGT TCC TCC G-3′92 ℃2 min 30 s、72 ℃40 s、55 ℃退32 s 40 s；SHP1上游引物：5′-ATC TGA GGC TTA GTC CCT GAG C-3′，下游引物5′-CTG AGG TCT CGG TGA AAC CAC-3′，92 ℃2 min 30 s、72 ℃40 s、55 ℃32 s 40 s。20μL體系。

1.2.2 Western blot 檢測(cè) Western blot 培養(yǎng)的細(xì)胞收集各樣本蛋白（蛋白裂解液購(gòu)自碧云天），SDS-PAGE電泳：配置10%濃度的分離膠，5%的積層膠；取50μg 蛋白質(zhì)與5 ×SDSPAGE 蛋白上樣緩沖液混合上樣量，積層膠80 V 30 min，分離膠100 V 120 min；冰浴下轉(zhuǎn)膜100 m A 120 min。5% TBST封閉1.5～2.0 h；SHP1 兔抗人單抗（1∶2000 稀釋），CD99 兔抗人單抗（1∶5000 稀釋），4 ℃孵育過(guò)夜，二抗（1∶5000稀釋）室溫孵育1 h，熒光成像儀內(nèi)曝光。

1.2.3 熒光共聚焦實(shí)驗(yàn)6 孔板培養(yǎng)L428 細(xì)胞48 h，再用無(wú)血清培養(yǎng)24 h，收取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，細(xì)胞懸液密度為1 ×106個(gè)／mL，1000 r／min，離心5 min，細(xì)胞沉淀0.01 mol／L，PBS 洗滌2～3 次；1000 r／min，離心5 min，棄去上清液；95%乙醇固定15 min，Triton X-100 破膜10 min。0.01 mol／L PBS洗滌3 次，5min，3% H2O28min，0.01mol／L PBS洗滌3 次，5 min，血清封閉5 min，甩去血清，分別用鼠抗人CD99、SHP1抗體孵育，4 ℃過(guò) 夜；0.01 mol／L PBS洗滌3次滴加相應(yīng)的二抗，37 ℃避光孵育30 min；PBS 沖洗；DPAI 復(fù)染，觀察拍照。

1.2.4 Si-RNA片段瞬時(shí)干擾6 孔板細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞密度為1 ×106個(gè)／mL，實(shí)驗(yàn)組加入10μL干擾片段＋240μL OPTIIMEN，靜置20 min，240μL OPTIIMEN＋10μL Lip2000，混合后靜置20 min，加入細(xì)胞中；對(duì)照組加入500μL 培基；37 ℃孵育，分別于48、72 h 進(jìn)行細(xì)胞相關(guān)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析；采用兩個(gè)獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 L428、IM9、KM3 淋巴瘤細(xì)胞SHP1和CD99 mRNA表達(dá)IM9中SHP1 mRNA高表達(dá)，而KM3、L428細(xì)胞中SHP1 mRNA表達(dá)較低；且與CD99 的表達(dá)趨勢(shì)相一致，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 RT-PCR 檢測(cè)IM9、KM3、L428 細(xì)胞中SHP1 和CD99 m RNA表 達(dá)

2.2 L428細(xì) 胞 和L428-CD99細(xì) 胞SHP1 mRNA表 達(dá)L428-CD99 細(xì)胞較L428細(xì)胞SHP1 mRNA表達(dá)要高，且與CD99 的表達(dá)趨勢(shì)相一致，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖2。

2.3 L428、L428-CD99、IM9、KM3 淋巴瘤細(xì)胞SHP1 和CD99蛋白表達(dá)Western blot 結(jié)果與m RNA基因表達(dá)水平相一致，IM9、KM3、L428-CD99 細(xì)胞中SHP1 表達(dá)較L428 細(xì)胞中高，且與CD99 的表達(dá)趨勢(shì)相一致。見(jiàn)圖3。

圖2 RT-PCR 檢測(cè)L428-CD99（L99）與L428 細(xì)胞株中SHP1 與CD99 m RNA的表達(dá)

圖3 Western blot 檢測(cè)IM9、KM3、L428、L428-CD99中SHP1 與CD99 的蛋白水平表達(dá)

圖4 在L428 細(xì)胞中熒光共聚焦檢測(cè)CD99 與SHP1 的表達(dá)

圖5 瞬時(shí)干擾CD99 后SHP1 在基因和蛋白水平的表達(dá)

2.4 L428 細(xì)胞CD99 與SHP1 的表達(dá)及其共定位 采用熒光共聚焦實(shí)驗(yàn)在L428細(xì)胞中檢測(cè)CD 99與SHP 1的表達(dá)部位，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行共定位，結(jié)果顯示CD99 主要表達(dá)于細(xì)胞膜，SHP1 主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，紫色為共定位部分。見(jiàn)圖4。

2.5 瞬時(shí)干擾CD99 后SHP1 在基因和蛋白水平的表達(dá) 在IM9 細(xì)胞中Si-RNA瞬時(shí)干擾CD99 后，用RT-PCR及Western blot 檢測(cè)SHP1 在基因和蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)CD99 后，SHP1 m RNA表達(dá)降低（圖5A、B），且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；蛋白水平表達(dá)趨勢(shì)與基因水平相一致（圖5C）。

3 討 論

SHP1 主要表達(dá)于造血細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)磷酸化水平的關(guān)鍵調(diào)控因子，在多數(shù)淋巴瘤和白血病細(xì)胞系（如NK-YS2、IWA3、MT1、EDS、ATLIK等）中低表達(dá)，其啟動(dòng)子高甲基化狀態(tài)導(dǎo)致的基因沉默是淋巴瘤、白血病發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制之一［6-7］。相反，SHP1蛋白在正常細(xì)胞中可以表現(xiàn)為正常表達(dá)或過(guò)度表達(dá)。SHP1 調(diào)節(jié)機(jī)能障礙可導(dǎo)致細(xì)胞的過(guò)度增長(zhǎng)，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［8-9］。HL是一種淋巴造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，1832年由英國(guó)的Thomas Hodgkin 最早描述，該疾病的典型形態(tài)特點(diǎn)是在大量的炎性反應(yīng)背景細(xì)胞中浸潤(rùn)少數(shù)的腫瘤性H／RS（hodgkin／reed-stern-berg）細(xì) 胞［5-10］。人CD99（Mic2）是一種相對(duì)分子質(zhì)量為32 ×103的跨膜糖蛋白，是HL 的潛在致瘤基因，參與造血細(xì)胞的分化等。研究報(bào)道H／RS 細(xì)胞的形態(tài)特征及免疫表型的變化與CD99蛋白表達(dá)缺失有關(guān)，CD99 是HL 形成的一個(gè)重要機(jī)制［11］。本研究熒光共聚焦檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)SHP1 為細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，CD99 為細(xì)胞膜表達(dá)，且二者有共定位部分。

Oka 等［12］通過(guò)表達(dá)譜芯片及組織微陣列技術(shù)證實(shí)SHP1基因在惡性淋巴瘤中表達(dá)明顯下降。本研究在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢測(cè)3 株B 系淋巴細(xì)胞IM9、KM3、L428 中SHP1 的表達(dá)，結(jié)果顯示SHP1 在HL細(xì)胞株L428 中表達(dá)最低；與CD99 的基因和蛋白水平表達(dá)趨勢(shì)有一致性。

JAK／STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡生物學(xué)作用的相關(guān)調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，該途徑異常激活是HL 形成的一個(gè)重要分子機(jī)制，但其異常激活的具體機(jī)制尚未完全明確［13-14］。SHP1 基因?yàn)榇嬖谟诩?xì)胞質(zhì)中的一種酪氨酸磷酸酶，是JAK／STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑負(fù)性調(diào)控因子之一。SHP1 基因沉默可以導(dǎo)致JAK／STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子活性增強(qiáng)，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展。本研究在課題組前期構(gòu)建的上調(diào)CD99 穩(wěn)定細(xì)胞株L428-CD99 中同樣在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢測(cè)SHP 1 基因和蛋白水平的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SHP1 隨著CD99 的上調(diào)而基因和蛋白水平表達(dá)升高。證實(shí)SHP1 在HL 中低表達(dá)可能與其CD99缺失有關(guān)，熒光共聚焦實(shí)驗(yàn)以及在IM9細(xì)胞株中瞬時(shí)干擾CD99 時(shí)，均 發(fā) 現(xiàn)CD99與SHP 1有相互關(guān)系。而CD 99與SHP1 的相互關(guān)系是否與SHP1 基因表達(dá)下調(diào)從而導(dǎo)致JAK／STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑失調(diào)有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。

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