介入法建立比格犬和小型豬急性心肌梗死模型的對比研究

顧曉龍，黃 軍，董正華，雷輝燕，龔志華，文艷飛，向定成△

（1．南方醫(yī)科大學研究生學院，廣州510515；2．廣州軍區(qū)總醫(yī)院心血管內科，廣州510010；3．廣州軍區(qū)總醫(yī)院超聲影像科，廣州510010）

建立急性心肌梗死動物模型已成為研究心血管疾病的常用方法，冠心病介入治療技術的成熟和普及為心肌梗死動物模型的建立提供了新的途徑［1-2］。但所采用的動物種類卻有不同的選擇，心血管模型常用的動物有小鼠、大白兔、犬、豬，其中小鼠是早期外科結扎建立心肌梗死模型的常用動物，不適用于介入法，介入法所常用的動物為犬和小型豬。本文分別用五指山小型豬和比格犬作為實驗動物，采用介入封堵法建立急性心肌梗死模型，從建立模型的成功率、風險等方面比較這兩種動物的差異，以期為急性心肌梗死模型選擇更合適的動物提供理論基礎。

1 材料與方法

1．1 實驗動物與材料 選取比格犬和五指山小型豬（批號：4407700010）各6只，雌雄不限，體質量15～22 kg，分為比格犬組和小型豬組。實驗材料有Siemens Artis數(shù)字減影血管造影機、6F動 脈 鞘 管 及0．035｀普 通 導 絲（Cor dis公 司），0．014｀Runthrough指引導絲（Terumo公司），6FJR3．5 Launcher指引導管（Medtronic公 司），2．0 mm×20．0 mm Sprinter球 囊（Medtronic公司），壓力泵、“Y”閥、三通板、高壓注射器、Philips M8004 A監(jiān)護儀、靜脈切開包、除顫儀、心電圖機、碘海醇注射液（揚子江藥業(yè)）。

1．2 術前準備與麻醉 兩組動物均在禁食8 h后，肌內注射氯胺酮200 mg，速眠新0．5 mL，咪達唑侖5 mg誘導麻醉，稱重并清洗，雙腹股溝及胸腹部備皮，運至介入室，將動物仰臥四肢固定于手術臺，牙墊固定，持續(xù)吸氧。耳后靜脈打套管針給以5%葡萄糖250 mL＋10%氯化鉀靜脈滴注，接胸部及四肢電極，記錄術前及術中心電圖，同時接心電監(jiān)護觀察心率及心律，除顫儀接電極同步除顫備用。給以氯胺酮2．5 mg＋咪達唑侖0．25 mg·kg-1·h-1維持麻醉，根據(jù)肢體活動及眼球轉動情況、呼吸頻率對麻醉藥物進行調整，術前30 min靜脈滴注1次青霉素480萬U＋氯化鈉100 mL。

1．3 模型建立 常規(guī)消毒鋪巾，切開并暴露右側股動脈，直視下穿刺股動脈，置入6F動脈鞘管，退出短導絲，從鞘管給以肝素5 000 U，肝素鹽水沖管，在DSA機透視下，經(jīng)導絲引導，送入6FJR3．5指引導管到左冠開口，根據(jù)左冠開口形狀將導管頭適當塑形，選擇左前斜30°＋頭位30°行左冠狀動脈造影，觀察清楚前降支走行后，送入0．014英寸×185 cm Runthrough指引導絲到前降支遠端，根據(jù)前降支中段內徑選擇2．5 mm×20．0 mm Sprinter球囊，定位于前降支中段（第二對角支開口后），3～4 at m擴張球囊，造影確認冠狀動脈血流完全中斷，先進行缺血預適應，先后阻斷前向血流1、2、5 min，每次間隔1 min，缺血預適應的時間根據(jù)心電監(jiān)護是否有頻發(fā)室性早搏、室性心動過速或房室顫動決定，心律相對穩(wěn)定，然后持續(xù)阻斷前向血流180 min，180 min后撤出球囊、導絲，術中如出現(xiàn)室性心動過速、房室顫動、低血壓、呼吸停止，均按照臨床治療原則給以搶救。

1．4 術后處理 手術結束后結扎股動脈穿刺口近端及遠端，逐層縫合，縫合皮膚前生理鹽水沖洗傷口，清除傷口內的積血，并局部應用慶大霉素4萬U，乙醇消毒傷口，對皮后紗布覆蓋彈力膠帶固定，兩組動物均送回動物實驗室，給以青霉素480萬U每日2次肌內注射，持續(xù)3 d。

1．5 急性心肌梗死的評估

1．5．1 心電圖檢測 分別于術前、術后30 min、術后3 h、術后24 h行肢體導聯(lián)及胸導聯(lián)心電圖檢查。

1．5．2 血心肌酶學指標檢測 分別于術前、術后12 h和術后24 h從動物股靜脈取5 mL靜脈血標本留樣，檢測上述時間點的肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB），肌鈣蛋白I（TnI）濃度。

1．5．3 心肌大體標本及病理染色 術后7 d，靜脈滴注10%氯化鉀注射液20 mL處死動物，并取出兩組動物心臟，觀察大體標本，后離斷大血管，切除右室部分，分別從梗死區(qū)和非梗死區(qū)切取標本，甲醛固定后制成蠟塊，作病理切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察。

1．6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13．0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，計量資料用±s表示，組間比較采用配對t檢驗，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2．1 一般狀況 比格犬組犬均存活，無1例死亡；小型豬組1例死亡，病死率16．67%（1／6），死亡原因為封堵后30 min出現(xiàn)頑固性房室顫動死亡。小型豬組術中每例均有超過1次的房室顫動或室性心動過速，比格犬組均無房室顫動及室性心動過速發(fā)生。兩組動物均無感染、出血及休克發(fā)生。兩組造模所用時間比較［（4．61±0．47）h vs．（4．82±0．55）h］，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。見表1。

表1 兩組一般狀況比較（n＝6）

2．2 造影結果 兩組動物均成功完成左冠狀動脈造影，均未行右冠狀動脈造影，用6FJR3．5指引導管代替造影管行冠狀動脈造影。小型豬組左冠狀動脈兩支血管分布相對均衡，且大部分前降支支配范圍廣泛，而比格犬組前降支相對細小，回旋支粗大。球囊封堵冠狀動脈后血流心肌梗死溶栓治療（TI MI）0級，有時球囊擴張近段可見血管痙攣影像。

2．3 心電圖改變 所有小型豬組在球囊封堵后立即出現(xiàn)T波高尖、ST段抬高等急性心肌梗死表現(xiàn)，而比格犬組均未見T波高尖，3例未出現(xiàn)顯著ST段抬高，3例出現(xiàn)輕度而短暫的ST段抬高，但約20 min左右ST段回落。

2．4 血液心肌酶學指標比較 兩組實驗動物術前各項指標比較，差異無統(tǒng)計學意義。術后12 h、術后24 h，小型豬組TnI、CK、CK-MB 3種指標均顯著高于比格犬組（P＜0．05）。見表2。

2．5 病理結果 1周后解剖心臟大體標本，5只存活的小型豬前壁均能看到室壁變薄，顏色明顯蒼白，而比格犬大體標本5只外觀未見明顯異常，1只可見前壁顏色稍白，見圖1、2。病理切片HE染色小型豬組均可見細胞壞死、淋巴細胞浸潤、纖維組織增生，而比格犬組5只未見明顯細胞壞死，僅可見極少量心肌纖維組織增生，1只可見心肌細胞壞死、淋巴細胞增生。

表2 兩組動物血液心肌酶指標比較分析（±s）

表2 兩組動物血液心肌酶指標比較分析（±s）

a：P＜0．05，與比格犬組比較。

指標術后12 h小型豬組 比格犬組術后24 h小型豬組 比格犬組TnI（ng／d L） 6．83±1．02 a 0．87±0．19 5．46±0．97 a 0．72±0．16 CK（U／L） 1 968．48±129．34 a 457．28±70．89 1 783．53±110．75 a 402．65±87．78 CK-MB（U／L） 221．03±38．47a 52．77±16．54 198．45±23．38 a 46．50±11．62

圖1 小型豬大體標本

圖2 比格犬大體標本

3 討 論

目前用于急性心肌梗死模型制作的動物種類有小鼠、大鼠、小型豬、犬、貓、兔、羊等，早期使用且現(xiàn)在仍被廣泛使用的是鼠［3］，但鼠由于體積小，心臟也很小，不便于采取血標本，耐受能力很差，病死率高等，并不是一種理想的心肌梗死造模動物。近年來，球囊封堵法建立心肌梗死模型已逐漸被研究者使用［4］，因為這種方法將對實驗動物機體的生理狀態(tài)干擾降到最小。犬和豬是最常用的實驗動物，體型適中，方便導管操作，且這兩種動物的心臟解剖、生理特性與人比較接近，實驗結果較鼠、兔等更具有說服力，便于過渡到人類的臨床實驗。

豬和犬冠狀動脈分布及解剖有著顯著的不同。犬基本為左冠狀動脈優(yōu)勢型，且多數(shù)左回旋支粗大，前降支細小，尤其是側支循環(huán)非常豐富，完全阻斷心肌供血變得非常困難，這和本實驗觀察的一致，實驗過程中完全阻斷前降支血流后，3例比格犬出現(xiàn)ST段輕度抬高，但數(shù)分鐘后即恢復正常，此時重復造影，前降支血流仍為TI MI 0級，3只封堵后心電圖無任何改變，分析其原因可能與犬豐富的側枝循環(huán)有關，這當中3例比格犬的側枝平時即處于開放狀態(tài)，側支在主支血管閉塞時開放。而小型豬冠狀動脈的解剖及分布特點與人類相似度更高，尤其是左冠狀動脈分布特點，與人類的符合度約占90%［5］，且側支循環(huán)極少，對缺血耐受性差，冠狀動脈血流急性閉塞尤其是前降支閉塞后極易引起大面積心肌梗死及惡性心律失常、心源性休克等并發(fā)癥，病死率較高［6-7］。本研究中6例小型豬，有1例因頑固性房室顫動和室性心動過速死亡，且所有小型豬在冠脈封堵后立即出現(xiàn)顯著ST段抬高，且抬高程度逐漸增加，在封堵后3～10 min均出現(xiàn)室性心律失常，即使經(jīng)過缺血預適應，所有小型豬均除顫2次以上，在封堵后均出現(xiàn)血壓不同程度下降，經(jīng)過藥物處理后血壓可回升。

急性心肌梗死的診斷方法較多，包括心電圖、肌鈣蛋白在內的心肌標志物檢測等［8］、病理學檢查等，其中組織學行病理檢查是較敏感可靠的特異性指標，且心肌梗死的組織學改變常早于血液指標及超聲心動圖的變化［9］。因此本研究選擇病理學診斷結合連續(xù)觀察心電圖作為診斷急性心肌梗死的標準，既節(jié)約成本，又方便可靠。本研究中所有小型豬除1例死亡外大體標本不經(jīng)過任何處理即可見前壁心肌不同程度的變白，比格犬的大體標除1例外均未見到顏色明顯變化，病理切片HE染色顯示小型豬組心肌細胞壞死，少量散在中性粒細胞及單核、淋巴細胞浸潤，纖維細胞增生，而比格犬組除1例外僅可見極少量纖維組織增生。

綜上所述，小型豬使用球囊封堵前降支制作急性心肌梗死模型成功率顯著高于比格犬，雖然模型建立風險顯著高于比格犬，但其仍有相對較高的成功率。為提高小型豬的存活率，作者認為，一個完善的實驗團隊是進行動物實驗的根本，其中包括有臨床經(jīng)驗的心血管介入醫(yī)師、超聲醫(yī)師、麻醉指導、動物實驗室的指導；其次就是對于心律失常及血栓等做好預備工作，比如術前即開始補鉀［10］，充分肝素化［11］，以及充分的缺血預適應［12］；最后是出現(xiàn)任何病情變化時應按照臨床的搶救原則進行積極搶救，而這些均需建立在豐富的臨床經(jīng)驗以及一定的實驗基礎上。

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