過氧化物酶體增殖物激活受體γ在哮喘患者淋巴細(xì)胞中的表達(dá)

張春容，趙 燕，王導(dǎo)新△

（1．重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院急診科 402160；2．重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科 400016）

支氣管哮喘是慢性氣道炎癥性疾病，其發(fā)病過程涉及多種細(xì)胞及細(xì)胞組分。其中，肺組織內(nèi)原有的Th1／Th2免疫應(yīng)答失衡，主要是Th2細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答增強致氣道嗜酸性粒細(xì)胞聚集增多和氣道高反應(yīng)性，是重要發(fā)病機(jī)制［1］。過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated recep-tor，PPAR）屬于核激素受體超家族成員，分為3個亞型，其中，PPARγ具有調(diào)節(jié)脂肪代謝、抗炎和調(diào)節(jié)免疫等多種生物學(xué)效應(yīng)［2-3］。且其在肺內(nèi)多種細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等廣泛表達(dá)，是肺內(nèi)炎癥和免疫調(diào)節(jié)可能的作用靶點。本實驗擬探討哮喘患者淋巴細(xì)胞PPARγ表達(dá)的變化，旨在從哮喘發(fā)病的機(jī)制入手尋求新的治療藥物，阻止疾病進(jìn)展，使哮喘患者獲得更佳的臨床療效。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選擇2012年10月至2013年6月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院住院治療的42例哮喘患者為研究對象（哮喘組）。入選標(biāo)準(zhǔn)：符合中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會哮喘學(xué)組的診斷標(biāo)準(zhǔn)，即（1）有典型的哮喘病史大于1年；（2）支氣管激發(fā)試驗陽性或支氣管舒張試驗陽性。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并嚴(yán)重的心、肝、腎功能不全；（2）合并支氣管擴(kuò)張、肺結(jié)核、塵肺等慢性肺病疾病者；（3）合并惡性腫瘤；（4）病程中病情加重，需氣管插管輔助通氣和重癥監(jiān)護(hù)。沙丁胺醇為受試者惟一急救藥物。將同期在本院體檢的40名健康者作為對照（健康對照組）。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）身體各部位有可疑感染病灶；（2）血常規(guī)白細(xì)胞計數(shù)大于10×109個／L，或炎癥細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞）大于參考值上限。兩組受試者的基線資料見表1。

表1 受試者一般資料

1．2 方法

1．2．1 病史采集內(nèi)容 采集內(nèi)容包括年齡、性別、病程、吸煙史、家族史等。住院患者采用甲潑尼龍40～100 mg／d治療1～5 d，在糖皮質(zhì)激素治療前、治療后2 d和治療后4 d分別留取相應(yīng)標(biāo)本進(jìn)行檢測分析。

1．2．2 定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Q-PCR）檢測外周血淋巴細(xì)胞PPARγmRNA表達(dá)情況 收集40名健康受試者外周血標(biāo)本，1∶1加入淋巴細(xì)胞分離液，收集白膜層。使用TAKARA試劑盒提取42名哮喘患者治療前，治療后2 d和治療后4 d淋巴細(xì)胞總RNA。PPARγ基因上游引物5′-CAA GCC CAG TCC TTT CTG TG-3′，下 游 引 物5′-AGT GAA GGA ATC GCT TTC CG-3′。β-actin上游引物5′-CTG GGA CGA CAT GGA GAA AA-3′，下游引物5′-AGG AAG GCT GGA AGA GTG C-3′。按美國羅氏公司Syber GreenⅠ試劑盒說明書操作，95℃預(yù)變性10 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，共42個循環(huán)。

1．2．3 痰誘導(dǎo)及標(biāo)本收集 按文獻(xiàn)［4］推薦方法進(jìn)行誘導(dǎo)痰細(xì)胞學(xué)分類和計數(shù)。入選患者誘導(dǎo)前15 min吸入沙丁胺醇400μg，然后給予超聲霧化吸入3%高滲鹽水，2～5 min后，指導(dǎo)患者主動排痰，并收集痰液。加入4倍體積的0．1%二硫蘇糖醇，37℃水浴10 min，2 000 r／min離心5 min。細(xì)胞沉淀涂片，瑞氏-吉姆薩混合染液染色10 min，光鏡下對不少于400個非鱗狀上皮細(xì)胞進(jìn)行分類和計數(shù)。細(xì)胞分類的正常上限：嗜酸性粒細(xì)胞比例為0．5%，中性粒細(xì)胞比例為65%。誘導(dǎo)痰上清收集凍存于-70℃冰箱用于細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-5（IL-5）檢測，酶聯(lián)免疫吸附法測定IL-5水平。

1．3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Graphpad5．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析和作圖。計量資料以±s表示，多組計量資料方差齊時組間比較采用單因素方差分析；方差不齊時采用秩和檢驗分析。雙側(cè)檢驗，檢驗水準(zhǔn)α＝0．05，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 患者治療前后PPARγ基因表達(dá)特點 以健康對照組淋巴細(xì)胞中PPARγ基因擴(kuò)增平均CT值為比較基準(zhǔn)，按2-△△CT法計算治療前、治療后2 d和治療后4 d各組平均的PPARγ基因表達(dá)倍數(shù)。與健康對照組比較，哮喘組患者在治療前PPARγ表達(dá)最低，治療后PPARγ基因表達(dá)逐步上調(diào)。見圖1。

圖1 PPARγmRNA在受試者淋巴細(xì)胞中的擴(kuò)增倍數(shù)

2．2 患者治療前后誘導(dǎo)痰上清IL-5水平 健康對照組誘導(dǎo)痰上清IL-5水平極低，部分標(biāo)本低于試劑盒檢測下限不能測出。哮喘組患者治療前和治療后2 d誘導(dǎo)痰上清仍能測出較高水平的IL-5，兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。在治療后4 d，IL-5水平顯著下降。見圖2。

2．3 患者治療前后誘導(dǎo)痰嗜酸性粒細(xì)胞比例分析 健康對照組人群誘導(dǎo)痰嗜酸性粒細(xì)胞比例均在正常參考值范圍內(nèi)。哮喘組患者痰嗜酸性粒細(xì)胞比例在治療前最高，治療后2 d逐漸下降，治療后4 d顯著降低。見圖3。

圖2 ELISA檢測受試者誘導(dǎo)痰上清中IL-5水平

圖3 受試者誘導(dǎo)痰中嗜酸性粒細(xì)胞比例

3 討 論

哮喘自身發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，固有免疫缺陷、適應(yīng)性免疫應(yīng)答失衡和植物神經(jīng)功能紊亂都一定程度參與疾病的發(fā)生進(jìn)展。此外，文獻(xiàn)報道性別、肥胖、吸煙、感染等多種因素均對哮喘發(fā)病有影響［4-7］。有必要從哮喘發(fā)病的根本免疫機(jī)制入手，尋求可能有效的治療靶點或方案?；罨腡h2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5和IL-13，參與炎癥細(xì)胞的募集、氣道高反應(yīng)性的誘發(fā)、黏液高分泌和氣道重塑等多個哮喘病理過程。文獻(xiàn)報道可根據(jù)哮喘患者痰中IL-5 mRNA水平劃分病情輕重等級，因此本實驗選擇IL-5為Th2細(xì)胞功能的檢測指標(biāo)［8］。

實驗結(jié)果顯示，哮喘急性發(fā)作時，誘導(dǎo)痰中嗜酸性粒細(xì)胞比例增加同時誘導(dǎo)痰上清中檢測到IL-5水平顯著增高。兩項指標(biāo)的變化趨勢一致。Th2細(xì)胞通過分泌IL-5等細(xì)胞因子募集嗜酸性粒細(xì)胞至氣道，參與哮喘的發(fā)病。而嗜酸性粒細(xì)胞作為主要的效應(yīng)細(xì)胞，聚集在氣道和血管周圍，維持哮喘的慢性炎癥狀態(tài)，并誘發(fā)氣道高反應(yīng)性，是哮喘急性發(fā)作的重要原因。也有文獻(xiàn)報道，IL-5不僅對嗜酸性粒細(xì)胞有募集作用，還能抑制凋亡，將其存活時間由4 d延長至2周［9］。

分離外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)水平檢測，結(jié)果提示哮喘組患者PPARγmRNA表達(dá)水平在入院時顯著低于健康對照組。經(jīng)過治療，其表達(dá)逐漸增高，甚至有部分患者在治療后4 d已表現(xiàn)出比健康對照組更高的水平。PPARγ的表達(dá)與嗜酸性粒細(xì)胞比例和IL-5水平的變化趨勢相反。推測PPARγ的抗炎作用可能是通過抑制Th2細(xì)胞功能，降低IL-5的分泌實現(xiàn)的。這同周煒等［10］的報道一致：支氣管哮喘及喘息性肺炎患兒外周血PPARγ表達(dá)減少，可使炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增強，導(dǎo)致患兒哮喘發(fā)作和發(fā)生喘息。分離培養(yǎng)哮喘患者外周血T淋巴細(xì)胞，使用以羅格列酮為代表的噻唑烷二酮類藥物特異激活PPARγ后，IL-4分泌水平較健康者顯著降低，與T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄信號相關(guān)的p-STAT6蛋白表達(dá)明顯降低，且兩者表達(dá)水平呈正相關(guān)［11］。

在用卵清蛋白致敏和激發(fā)的小鼠哮喘模型中，羅格列酮通過核因子-κB（NF-κB）通路抑制T細(xì)胞因子和血清相應(yīng)卵清蛋白抗體的產(chǎn)生，并能降低氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥水平，發(fā)揮保護(hù)作用［12］。雖然已有不少研究證實激活PPARγ對哮喘動物模型有確切的保護(hù)作用，但仍存在一些局限。PPARγ作為核受體超家族的一員，能調(diào)控多種細(xì)胞的增殖分化。基于此，尚無法在PPARγ基因敲除動物體內(nèi)驗證其對哮喘的保護(hù)作用。仍需要大量關(guān)于PPARγ與哮喘的基礎(chǔ)研究和臨床研究進(jìn)一步驗證可能的作用機(jī)制和作用效能。同時注意噻唑烷二酮類藥物對血糖的影響。

綜上所述，哮喘患者急性發(fā)作時Th2細(xì)胞激活，分泌高水平IL-5，募集嗜酸性粒細(xì)胞至氣道周圍聚集。隨著PPARγ表達(dá)水平的上調(diào)，哮喘的氣道炎癥程度降低，IL-5分泌減少。PPARγ對哮喘的保護(hù)作用可能是通過抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的功能實現(xiàn)的。PPARγ是哮喘患者可能的新治療靶點，其激動劑有望用于臨床，使患者獲得良好的臨床控制。

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