PD-L2在宮頸鱗狀細(xì)胞癌的表達(dá)及對(duì)外周血T細(xì)胞凋亡的影響＊

耿衛(wèi)樸，徐 曼，張 燕，陳 瑜，黃文煉，王婷婷

（重慶醫(yī)科大學(xué)病理教研室／分子與腫瘤研究中心 400016）

我國(guó)宮頸癌的發(fā)病率近年來逐漸增高并出現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，宮頸鱗狀細(xì)胞癌是最主要的組織學(xué)類型。宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生與乳頭瘤病毒感染密切相關(guān)，但病毒感染后僅少部分病例發(fā)展為癌，提示癌變細(xì)胞未能被局部微環(huán)境的T細(xì)胞識(shí)別和清除。宮頸癌微環(huán)境出現(xiàn)T細(xì)胞免疫水平下降與宮頸局部出現(xiàn)負(fù)性共刺激分子如B7家族成員、調(diào)節(jié)T細(xì)胞浸潤(rùn)以及白細(xì)胞介素（IL）-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）水平增高等因素有關(guān)。PD-L2是共刺激分子B7家族成員之一，它與T細(xì)胞表面的PD-1受體結(jié)合后通過PD-L2／PD-1信號(hào)途徑影響T細(xì)胞增殖及分泌細(xì)胞因子，負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化并促進(jìn)T細(xì)胞凋亡，從而抑制人體的抗腫瘤免疫［1-2］。癌細(xì)胞表達(dá)PD-L2還能促進(jìn)癌細(xì)胞逃避宿主機(jī)體的免疫監(jiān)視［3］。文獻(xiàn)報(bào)道PD-L2在多種惡性腫瘤如肺癌、肝癌、食管癌、胰腺癌、子宮頸癌和卵巢癌細(xì)胞異常表達(dá)，PD-L2與腫瘤內(nèi)CD8＋T細(xì)胞減少相關(guān)，在腫瘤原發(fā)部位及其轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)內(nèi)均能抑制效應(yīng)T細(xì)胞的抗腫瘤免疫功能，而且癌細(xì)胞表達(dá)PD-L2與患者預(yù)后差密切相關(guān)［4-6］，但對(duì)PD-L2調(diào)節(jié)T細(xì)胞凋亡的作用目前尚未見報(bào)道。為進(jìn)一步闡明PD-L2／PD-1信號(hào)途徑在調(diào)節(jié)子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者抗腫瘤T細(xì)胞免疫中的作用，本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法觀察PD-L2在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織的表達(dá)，分析PDL2表達(dá)與患者臨床病理特征的相關(guān)性，并通過體外實(shí)驗(yàn)觀察了可溶性PD-L2蛋白對(duì)宮頸癌患者外周血活化T細(xì)胞凋亡的影響。

1 資料與方法

1．1 一般資料 正常宮頸組織30例，高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）Ⅱ、Ⅲ級(jí)30例和宮頸鱗狀細(xì)胞癌60例均取自重慶醫(yī)科大學(xué)病理教研室2009～2010年的病理標(biāo)本?；颊吣挲g32～65歲，平均43．12歲。免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)采用10%中性甲醛固定、石蠟包埋組織。外周血取自重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科未經(jīng)化療的宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者。采血前已得到患者及其家屬的同意，并通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

1．2 主要試劑 兔抗人PD-L2（bs-1868 R）和鼠抗人PD-1（bs-1867R）購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；重組人PD-L2活性蛋白（10292-H08 H）購(gòu)自北京Sino Biological公司；PV-6000試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊镉邢薰荆籖PMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Annexin V-PE／7-AAD凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)有限公 司；小 鼠Ig G1-PE（No．12-4714）、Ig G1-FITC（No．11-4714）、鼠抗人CD8-FITC（No．11-0086）和鼠抗人CD4-FITC（No．11-0049）購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；尼龍毛購(gòu)自德國(guó)Kisker公司；聚羥基脂肪酸酯購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司。

1．3 方法

1．3．1 免疫組織化學(xué)染色 4μm石蠟切片脫蠟至梯度乙醇后，經(jīng)3%H2O2孵育10 min及枸櫞酸鈉緩沖液（p H 6．0）進(jìn)行抗原修復(fù)后，滴加PD-L2抗體（1∶150）并于4℃冰箱過夜；加二抗后37℃溫箱孵育30 min，以上各步后均用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，最后經(jīng)DAB顯色并用中性樹脂封片。實(shí)驗(yàn)中用PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。PD-L2在細(xì)胞膜或胞質(zhì)著色為陽性（＋～＋＋＋），其中染色細(xì)胞數(shù)10%～25%，染成淡棕色為＋、＋＋；染色細(xì)數(shù)胞大于25%，染成棕褐色＋＋＋；否則為陰性（-）。

1．3．2 外周血T細(xì)胞的分離活化與培養(yǎng) 宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者的新鮮抗凝外周血經(jīng)梯度離心后吸取單個(gè)核細(xì)胞，再經(jīng)尼龍毛獲得T淋巴細(xì)胞。將T淋巴細(xì)胞分為對(duì)照組、重組PDL2組和PD-L2＋抗PD-1組。在24孔板內(nèi)將5×105mL-1T淋巴細(xì)胞置于RPMI1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清10 mg／L）中37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，3組分別加入PBS、重組人PD-L2蛋白（1μg／mL）和抗人PD-1抗體（2μg／mL）培養(yǎng)48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。每組實(shí)驗(yàn)分別重復(fù)3次。

1．3．3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞凋亡率 收集上述各組T淋巴細(xì)胞，1×106個(gè)T細(xì)胞懸浮于100μL磷酸鹽緩沖液（PBS）后分別與鼠抗人CD8-FITC、鼠抗人CD4-FITC和Annexin VPE室溫避光孵育30 min，再加入7 AAD避光孵育5 min，PBS洗3次后立即用400μL PBS重懸細(xì)胞并進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，偏態(tài)分布資料采用Fisher精確概率檢驗(yàn)法，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)法。臨床病理特征與PD-L2表達(dá)的關(guān)系的分析采用Logistic回歸分析。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 PD-L2在人正常宮頸上皮、CINⅡ、Ⅲ級(jí)和宮頸鱗狀細(xì)胞癌的表達(dá) PD-L2在部分正常宮頸鱗狀上皮的基底層細(xì)胞微弱表達(dá)，陽性率為20．0%（6／30）；在部分CINⅡ、Ⅲ級(jí)細(xì)胞中微弱表達(dá)，陽性率為20．0%（6／30）；但在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌的陽性表達(dá)率為53．3%（32／60），顯著高于CINⅡ、Ⅲ級(jí)的表達(dá)率（P＜0．05），見圖1、表1。此外，PD-L2蛋白也在宮頸鱗狀細(xì)胞癌局部的間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。

2．2 PD-L2表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性分析 本實(shí)驗(yàn)對(duì)宮頸鱗狀細(xì)胞癌PD-L2的表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部脈管內(nèi)瘤栓形成以及患者臨床分期和年齡進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示PD-L2的表達(dá)與癌細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＝0．023）。進(jìn)一步進(jìn)行Logistic回歸分析顯示，PD-L2表達(dá)與癌細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在2例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸鱗狀細(xì)胞癌病例中，轉(zhuǎn)移灶和原發(fā)灶癌細(xì)胞均表達(dá)PD-L2；另2例原發(fā)灶癌細(xì)胞不表達(dá)PD-L2，但轉(zhuǎn)移灶內(nèi)癌細(xì)胞強(qiáng)陽性表達(dá)PD-L2。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)同一病例中PD-L2在淺表浸潤(rùn)的癌細(xì)胞中表達(dá)略弱于深部浸潤(rùn)的癌細(xì)胞，但統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果未能證實(shí)PD-L2表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度的相關(guān)性，見表2。

圖1 PD-L2在不同組織的表達(dá)

表1 PD-L2在宮頸鱗狀細(xì)胞癌和CINⅡ、Ⅲ組的表達(dá)（n）

表2 宮頸鱗狀細(xì)胞癌表達(dá)PD-L2與臨床 病理特征的相關(guān)性［n（%）］

續(xù)表2 宮頸鱗狀細(xì)胞癌表達(dá)PD-L2與臨床 病理特征的相關(guān)性［n（%）］

2．3 PD-L2蛋白對(duì)患者外周血T細(xì)胞凋亡的影響 重組人PD-L2與宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者外周血T細(xì)胞混合培養(yǎng)72 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示PD-L2組T淋巴細(xì)胞總凋亡率為26．0%，其中CD8＋T和CD4＋T細(xì)胞凋亡率分別為22．4%和17．0%；對(duì)照組T淋巴細(xì)胞總凋亡率為20．2%，其中CD8＋T和CD4＋T淋巴細(xì)胞凋亡率分別為16．2%和9．0%；PD-L2組T細(xì)胞、CD8＋T和CD4＋T淋巴細(xì)胞凋亡率均明顯高于空白對(duì)照組。然而在加入抗PD-1阻斷PD-L2與T淋巴細(xì)胞的PD-1結(jié)合后，PD-L2＋抗PD-1組T細(xì)胞、CD8＋T和CD4＋T淋巴細(xì)胞凋亡率均明顯下降，分別為21．8%、17．5%和11．1%，見圖2、3。

圖2 混合培養(yǎng)T細(xì)胞的凋亡率

圖3 T淋巴細(xì)胞凋亡率

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，宮頸鱗狀細(xì)胞癌異常表達(dá)PD-L2，其陽性表達(dá)率為53．3%，顯著高于CINⅡ、Ⅲ級(jí)細(xì)胞及正常宮頸鱗狀上皮細(xì)胞，也高于文獻(xiàn)報(bào)道宮頸癌細(xì)胞表達(dá)PD-L2為29．0%的陽性率，原因可能和國(guó)外患者與本實(shí)驗(yàn)患者之間存在種族差異以及組織芯片取材范圍局限有關(guān)。本研究還觀察到宮頸癌部分間質(zhì)細(xì)胞異常表達(dá)PD-L2，結(jié)合前期研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌局部浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞表達(dá)PD-L2受體PD-1，以及文獻(xiàn)報(bào)道活化T淋巴細(xì)胞表達(dá)PD-L2與抑制T細(xì)胞增殖和分泌細(xì)胞因子有關(guān)［7］，推測(cè)宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)PD-L2蛋白可能與浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞表達(dá)的PD-1受體結(jié)合，從而發(fā)揮對(duì)宮頸癌患者微環(huán)境的免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用。

PD-L2與T細(xì)胞的PD-1受體特異結(jié)合而負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫［8-9］。作者在前期實(shí)驗(yàn)中觀察到人外周血活化T淋巴細(xì)胞和宮頸癌組織內(nèi)浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞大部分表達(dá)PD-1，而且宮頸癌微環(huán)境內(nèi)浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞存在凋亡的現(xiàn)象［10］。文獻(xiàn)報(bào)道PD-L2既可通過PD-l胞漿區(qū)C端的免疫受體酪氨酸抑制基序下調(diào)PI3 K／Akt激酶活性，抑制T細(xì)胞增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄并促進(jìn)T細(xì)胞凋亡［11］；也可招募酪氨酸磷酸酶-1和酪氨酸磷酸酶-2，使相應(yīng)的信號(hào)分子去磷酸化，從而抑制T細(xì)胞增殖活化并使其喪失免疫功能［12］。有研究發(fā)現(xiàn)，酪氨酸磷酸酶-1可使T細(xì)胞的ZAP70蛋白去磷酸化而抑制其增殖活化，還使p56lck失活而抑制腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)T細(xì)胞的溶瘤作用［13］。本研究將重組人PD-L2與宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者外周血T細(xì)胞混合培養(yǎng)后，觀察到PD-L2蛋白促進(jìn)外周血T細(xì)胞，CD8＋T和CD4＋T細(xì)胞凋亡，而且其促進(jìn)CD8＋T細(xì)胞凋亡的作用強(qiáng)于CD4＋T細(xì)胞；當(dāng)采用抗PD-1抗體阻礙T細(xì)胞PD-1受體與PD-L2結(jié)合后，T細(xì)胞、CD8＋T和CD4＋T細(xì)胞亞群的凋亡率均下降，提示PD-L2／PD-1途徑促進(jìn)了宮頸鱗狀細(xì)胞癌微環(huán)境內(nèi)T細(xì)胞凋亡，從而抑制其抗腫瘤免疫。近期報(bào)道不論采用抗體阻斷PD-L2或PD-1，或用RNA干擾技術(shù)敲除PD-L2基因均能促進(jìn)CD8＋T細(xì)胞增殖和發(fā)揮細(xì)胞毒功能［14］；阻斷PD-1使小鼠腫瘤局部浸潤(rùn)的CD8＋T和CD4＋T細(xì)胞數(shù)量增多，干擾素-γ水平增高并抑制了鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)宮頸鱗狀細(xì)胞癌PD-L2的異常表達(dá)與腫瘤微環(huán)境T細(xì)胞凋亡、抗腫瘤免疫受抑制，從而促進(jìn)腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。因此，PD-1／PD-L2途徑可能成為宮頸鱗狀細(xì)胞癌免疫治療的靶點(diǎn)之一。

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