轉(zhuǎn)錄因子Bli mp1在結(jié)核病患者外周血單個核細胞中的表達研究＊

章明徐，陳婉燕，謝小紅，張?？?，李發(fā)科，陳 鳴，鄧少麗

（第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所檢驗科，重慶400042）

結(jié)核病的控制一直以來備受關(guān)注，全世界每年新增結(jié)核病例1 000萬左右，而在我國每年新增病例100萬左右，是我國重點控制的重大疾病之一。傳統(tǒng)觀念認為在結(jié)核免疫機制中發(fā)揮主要作用的是細胞免疫［1］，近年來，體液免疫在結(jié)核發(fā)病機制中的作用越來越受到關(guān)注。目前已發(fā)現(xiàn)的調(diào)控體液免疫過程的轉(zhuǎn)錄因子主要有BCL6、Bli mp1、IRF4、MITF、MTA3、PAX5和XBP-1等，其中Bli mp1是1991年發(fā)現(xiàn)的由pr d m1基因編碼的蛋白，是漿細胞分化的主調(diào)控子［2-3］。有研究表明，Blimp1不僅可以調(diào)控B細胞和漿細胞的分化發(fā)育，還可參與調(diào)控免疫系統(tǒng)中髓系細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞的發(fā)育與功能。近期研究發(fā)現(xiàn)，Bli mp1對T細胞的增殖分化和免疫自穩(wěn)亦發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［4-6］。那么，在機體的抗結(jié)核免疫反應(yīng)中，Bli mp1是否會參與其中？本研究擬通過分析結(jié)核病患者與健康體檢者外周血單個核細胞中Blimp1 mRNA的表達情況，探討B(tài)limp1是否參與到機體抗結(jié)核免疫反應(yīng)過程中，為進一步探明結(jié)核發(fā)病機制、結(jié)核桿菌免疫清除及結(jié)核病診斷新分子提供實驗依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選擇2012年2月至2013年5月來本院就診的結(jié)核患者110例，根據(jù)病史、實驗室檢查將其分為活動期組（60例）和潛伏期組（50例）?；顒悠诮M男34例，女26例，年齡13～65歲，平均（34．0±5．6）歲；潛伏期組男31例，女19例，年齡13～65歲，平均（34．0±6．4）歲。上述患者診斷均符合中華醫(yī)學會結(jié)核病分會制定的肺結(jié)核診斷和治療指南中的診斷標準［7］。同時排除肝、腎功能障礙患者，全身免疫性疾病患者，應(yīng)用糖皮質(zhì)激素類藥物或免疫抑制劑患者。選擇同期到本院的50例健康體檢者為對照組，排除吸煙、酗酒者，結(jié)核菌素試驗均為陰性，其中男23例，女27例，年齡16～78歲，平均（35．0±6．8）歲。

1．2 主要試劑與儀器 Ficoll細胞分離液購自GE公司，磷酸鹽緩沖液（PBS）購自北京中衫公司，Trizol購自Invitrogen公司，焦碳酸乙二酯原液購自Sig ma試劑公司，無核酸酶雙蒸水購自美國Pro mega公司，75%乙醇、異丙醇和氯仿購自重慶川東公司。熒光定量PCR試劑盒、Taq聚合酶購自美國Promega公司，PCR MIX混合液購自杭州博日科技有限公司，引物和探針在上海生工生物工程有限公司合成。美國CFX-96 Bio-Rad熒光定量PCR儀，美國ND-1000紫外分光光度計。

1．3 方法

1．3．1 分離外周血單個核細胞與提取總RNA 抽取結(jié)核病患者及健康體檢者的乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝靜脈血2 mL，取EDTA抗凝血1 mL，加至1 mL Ficoll細胞分離液表面，常溫下2 000 r／min離心20 min，用毛細吸管將標本中的單個核細胞分離出來，收集并用1%PBS洗滌，常溫下2 500 r／min離心10 min，去上清液留單個核細胞于管底。然后使用Trizol將細胞破裂，利用三氯甲烷、異丙醇和75%乙醇萃取、沉淀的原理，提取出細胞中的RNA。再將RNA溶解在無核酸酶水中，利用ND-1000紫外分光光度計定量檢測RNA的質(zhì)量和水平。

1．3．2 將RNA逆轉(zhuǎn)錄為c DNA 根據(jù)熒光定量PCR試劑盒說明書取1 mg的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，42℃孵育40 min得到c DNA，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1．3．3 熒光定量PCR檢測 對上述逆轉(zhuǎn)錄后得到的c DNA進行熒光定量PCR反應(yīng)，引物設(shè)計如下：Bli mp1上游5′-TCC AGC ACT GTG AGG TTT CA-3′，Blimp1下游5′-TCA AAC TCA GCC TCT GTC CA-3′。熒光探針，Blimp1 FAM-5′-ATG GAC ATG GAG GAT GCG GAT ATG-3′。內(nèi)參：B2M上游5′-TCC ATC CGA CAT TGA AGT TGA C-3′，B2M下游5′-ACT ATC TTG GGC TGT GAC AAA G-3′，B2M探針FA M-5′-TGG TTC ACA CGG CAG GCA TAC TCA-3′。熒光定量PCR反應(yīng)條件：95℃3 min；95℃10 s，55℃30 s，40個循環(huán)。根據(jù)熒光定量PCR儀得出的結(jié)果，計算活動期組、潛伏期組和對照組中每例標本的靶基因Bli mp1和相應(yīng)內(nèi)參基因B2M的ct值差值△ct，并計算活動期組、潛伏期組的和對照組，利用相對定量2-△△ct法（-△△ct＝活動期組／潛伏期組-對照組）計算活動期組、潛伏期組和對照組之間Bli mp1 mRNA表達的差異。

1．4 統(tǒng)計學處理 利用Graphpad Pris m軟件將對照組、活動期組及潛伏期組的ct值和△ct值繪圖分析。采用SPSS17．0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗進行兩組間差異比較，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。t檢驗以△ct均值計算△△ct，并利用相對定量2-△△ct法計算Bli mp1基因表達差異倍數(shù)。

2 結(jié) 果

2．1 外周血單個核細胞RNA質(zhì)量及擴增特異性 所有樣本提取總RNA水平均不小于300 ng／μL，吸樂度260／280均在1．75～1．95，提示總RNA質(zhì)量較好。靶基因Bli mp1和內(nèi)參基因B2M mRNA擴增曲線見圖1，溶解曲線見圖2。

圖1 熒光定量PCR擴增曲線

2．2 Blimp1 mRNA在3組中表達的差異 活動期組、潛伏期組和對照組Bli mp1和B2M基因的△ct值均呈正態(tài)分布?；顒悠诮MBli mp1相對于B2M的平均△ct值為5．36±2．45，潛伏期組相對于B2M的平均△ct值為2．40±1．86，對照組Bli mp1相對于B2M的平均△ct值為1．44±0．80，活動期組、潛伏期組與對照組之間平均△ct值的差異有統(tǒng)計學意義（P＝0．000），見表1。通過相對定量2-△△ct法計算，活動期組的Bli mp1 mRNA水平是對照組的15．35倍，潛伏期組的Bli mp1 mRNA水平是對照組的2．21倍，且組間Blimp1 mRNA表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。

圖2 溶解曲線

表1 各組間Bli mp1 mRNA相對定量表達差異

3 討 論

機體對結(jié)核桿菌的免疫反應(yīng)相當復雜，大體上可分為固有免疫和適應(yīng)性免疫。固有免疫主要包括被激活的巨噬細胞和致敏的T淋巴細胞；適應(yīng)性免疫主要依賴于特異性的細胞免疫，包括抗原呈遞與T細胞的識別、活化、應(yīng)答幾個階段。雖然細胞免疫在結(jié)核免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，但近年來體液免疫在結(jié)核病發(fā)病機制中的作用也引起了一定關(guān)注，研究提示細胞免疫與體液免疫在結(jié)核病發(fā)展過程中的作用是相輔相成、缺一不可的［1-2］。

調(diào)控體液免疫過程的轉(zhuǎn)錄因子Blimp1可以靶向結(jié)合多種基因，通過招募包括組蛋白去乙?；负图谆D(zhuǎn)移酶在內(nèi)的染色體修飾酶到特定核酸序列如啟動子序列，來抑制靶基因的表達，起著轉(zhuǎn)錄抑制因子的作用［7-8］。Bli mp1蛋白是促進成熟B淋巴細胞向漿細胞終末分化的主調(diào)控因子［9］，它可抑制與B淋巴細胞增殖有關(guān)的一系列基因的表達，如BCL6、PAX5、CMYC、CⅡTA、Id等，促進B淋巴細胞向漿細胞分化。Bli mp1蛋白還可以誘導成熟漿細胞分泌抗體，是維持骨髓中長壽命漿細胞所必需的轉(zhuǎn)錄因子。Bli mp1功能不僅局限于B細胞和漿細胞，還可參與調(diào)控免疫系統(tǒng)中髓系細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞的發(fā)育與功能。此外，Blimp1對T細胞的增殖分化和免疫自穩(wěn)亦發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，Bli mp1在Th2細胞中表達高于Th1細胞，而且缺乏Bli mp1的CD4＋T細胞將表現(xiàn)出受損的Th2體液反應(yīng)效應(yīng)，說明Bli mp1對Th2細胞的分化及功能的必要性。而且，在Blimp1缺失的兩個動物模型中，也發(fā)現(xiàn)受抗原刺激后CD4＋T細胞和Th1細胞均表現(xiàn)出更強的抗凋亡能力［10-11］，說明Bli mp1的正常功能之一就是促進效應(yīng)T細胞的凋亡。

那么，在結(jié)核發(fā)病及機體抗結(jié)核免疫反應(yīng)過程中，Bli mp1是否會參與其中？本研究發(fā)現(xiàn)，在活動期組血液中Blimp1 mRNA的表達水平為對照組的15．35倍，是潛伏期組結(jié)核患者的2．21倍，初步說明Bli mp1參與到機體抗結(jié)核的免疫反應(yīng)中。Bli mp1有可能作為診斷結(jié)核的新指標，作為診療結(jié)核的新靶點。Bli mp1在機體抗結(jié)核免疫反應(yīng)的具體機制還有待于進一步深入研究。

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