西藏豬模型對新型生物人工肝治療安全性的評估＊

熊龍輝，何國林，張 志，汪 艷，潘明新，高 毅

（南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院肝膽二科，廣州510282）

物理性人工肝對肝衰竭的臨床治療有一定的支持效果，但生物型人工肝的療效評價需進一步研究［1］。生物人工肝對肝衰竭模型治療效果的評價是一項復(fù)雜的工程，涉及動物肝衰竭模型的建立、生物反應(yīng)器中肝細胞的大量培養(yǎng)、治療過程中治療模式及參數(shù)的選擇、生命體征的監(jiān)護、治療前后血液指標變化、并發(fā)癥的防治等。若上述任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，可能會導(dǎo)致整個實驗失敗。故本研究利用西藏豬模型評估新型生物人工肝治療的安全性，希望能夠?qū)ι锶斯じ未髣游矬w外循環(huán)、腎臟透析、肝衰竭模型的療效評價及遠期臨床應(yīng)用提供一定的經(jīng)驗。

1 材料與方法

1．1 材料 6只40～50 kg雌性西藏豬，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（合格證號：SCXK粵2011-0015）。所需材料包括新一代組合型肝腎支持系統(tǒng)（由南方醫(yī)科大學(xué)和中國科學(xué)院電工研究所共同研制）、人工肝血液管路（自行設(shè)計）、膜型血漿分離器（日本旭化成可樂麗醫(yī)療株式會社）、一次性血液灌流器（HA330-Ⅱ）、一次性血液透析雙腔導(dǎo)管、一次性7F雙腔中心靜脈導(dǎo)管、有創(chuàng)血壓心電監(jiān)護儀、鹽酸氯胺酮注射液、丙泊酚注射乳劑。

1．2 方法

1．2．1 生物人工肝實驗豬模型制備 實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，術(shù)前禁食12 h，自由飲水。氯胺酮肌肉注射誘導(dǎo)麻醉結(jié)合股靜脈持續(xù)泵入丙泊酚維持麻醉，術(shù)中間斷追加咪達唑侖鎮(zhèn)靜，待麻醉滿意后，常規(guī)消毒鋪單，并心電監(jiān)護，觀察實驗過程中心電圖、心率、呼吸頻率、血氧飽和度。分別于股動脈及頸內(nèi)靜脈置管以備實驗用。

1．2．2 實驗豬肝腎支持系統(tǒng)上機 實驗豬上機前所有管路以及濾器先用肝素鹽水循環(huán)20 min，再用706代血漿預(yù)充管路，給予靜脈注射地塞米松5 mg，肌肉注射鹽酸異丙嗪注射液25 mg，經(jīng)雙腔管按0．5 mg／kg給予首劑肝素，啟動肝素泵，按0．05 mg·kg-1·h-1追加肝素，每小時監(jiān)測活化部分凝血酶時間（APTT），根據(jù)APTT值調(diào)整肝素泵的速率，治療結(jié)束前1 h停止追加肝素。血泵流量調(diào)節(jié)為50～60 mL／min，分漿泵流量調(diào)節(jié)為15 mL／min，倒向泵（LDP）1、LDP2流量調(diào)節(jié)為18 mL／min，反應(yīng)器往返周期為0．4 min。連接壓力監(jiān)測器檢查各個報警裝置。每頭實驗豬接受總共8 h的治療，前2 h模擬混合模式（血液吸附灌流聯(lián)合生物人工肝治療），后6 h模擬單純生物治療模式（撤掉灌流器），每隔1 h記錄1次靜脈壓、跨膜壓、入漿壺壓，動態(tài)監(jiān)測實驗豬的動脈血壓、血氧飽和度、心率、呼吸、心電圖。治療過程中，每隔2 h輸入0．9%生理鹽水200 mL進行沖管，以防止堵塞濾器和管路，密切注意豬的胸廓起伏、生命體征的變化。治療結(jié)束后，繼續(xù)觀察實驗豬飲食、飲水、生命體征變化。同時從實驗開始及實驗4、8 h股靜脈采血行血培養(yǎng)、內(nèi)毒素測定，具體由南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院檢驗科執(zhí)行。

1．3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13．0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以±s表示，樣本均數(shù)間比較采用單向方差分析，系統(tǒng)穩(wěn)定性采用質(zhì)量控制圖進行分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 一般狀況 6只豬在實驗過程中及實驗結(jié)束后均存活良好。實驗過程中未出現(xiàn)低血壓、高血壓、抽搐、透析綜合征、發(fā)熱、出血等不良反應(yīng)。治療7 d后未見發(fā)熱、切口感染、出血等并發(fā)癥。生物人工肝機器運行過程中無故障，無管路爆破、漏血，血漿分離器未見破膜等情況，實驗開始時及實驗4、8 h抽血所測得的內(nèi)毒素結(jié)果均小于0．5 EU／mL，血培養(yǎng)結(jié)果顯示培養(yǎng)15 d未見細菌生長?；旌夏Ｊ街委煂嶒瀳D見圖1。

2．2 實驗過程中生命體征變化 西藏豬在實驗過程中心電圖無明顯異常，各時間點平均動脈壓、呼吸頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），實驗2 h心率與實驗開始時比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），實驗2 h心率的均數(shù)落在質(zhì)控圖下限外，血氧飽和度、呼吸頻率、平均動脈壓樣本均數(shù)各時間點均在控制線內(nèi)，均能維持相對穩(wěn)定狀態(tài)，實驗5 h出現(xiàn)心率加快，血氧飽和度降低，平均動脈壓下降的情況。見表1。

表1 西藏豬實驗過程中各時間點生命體征變化（±s）

表1 西藏豬實驗過程中各時間點生命體征變化（±s）

時刻 心率（次／分）呼吸頻率（次／分）血氧飽和度（%）平均動脈壓（mm Hg）實驗開始時84±4 25±13 96±2 105±4 1 h 79±4 21±3 91±16 101±5 2 h 71±9 23±7 94±8 101±9 3 h 80±5 21±5 96±2 99±6 4 h 89±8 25±9 93±7 96±11 5 h 91±7 21±4 90±3 91±7 6 h 77±8 19±2 94±5 99±8 7 h 76±7 20±3 91±2 100±2 8 h 83±10 23±6 92±13 99±6

2．3 生物人工肝支持系統(tǒng)靜脈壓、跨膜壓、入漿壺壓變化 經(jīng)Welch法校正后的入漿壺壓及靜脈壓、跨膜壓均滿足方差齊性。經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)不同時間點之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝2．415、2．357、6．163，均P＜0．05），將實驗1～8 h的值與實驗開始時的值進行比較后發(fā)現(xiàn)，靜脈壓、跨膜壓、入漿壺壓在實驗5 h較實驗開始時明顯增高（P＜0．05），而其余各時間點與實驗開始時比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），見表2；除了實驗5 h的均數(shù)點落在控制線以外，其余各點均在控制線內(nèi)。

表2 生物人工肝機器的壓力值變化（±s，mm Hg）

表2 生物人工肝機器的壓力值變化（±s，mm Hg）

時刻 靜脈壓 跨膜壓 入漿壺壓實驗開始時78．3±4．6 61．2±1．6 46．5±2．2 1 h 78．7±1．5 58．2±5．4 45．5±1．6 2 h 75．3±4．6 62．5±1．7 46．1±3．1 3 h 78．2±5．0 58．2±2．7 44．8±5．3 4 h 79．5±4．7 64．5±2．4 49．0±4．2 5 h 84．4±5．8 68．6±1．8 52．0±3．9 6 h 76．7±4．3 60．7±3．1 46．2±3．9 7 h 81．1±3．5 58．0±5．4 47．0±2．9 8 h 76．1±4．5 58．1±4．9 46．4±2．1

圖1 混合模式治療實物圖

3 討 論

生物人工肝動物實驗的安全性問題主要涉及細胞、生物反應(yīng)器、人工肝機器、動物安全性的評估等方面。目前，國內(nèi)外細胞安全性問題主要是對豬逆轉(zhuǎn)錄病毒感染致癌性［2-4］、基因毒性［5-6］、免疫排斥［7］等的研究。生物反應(yīng)器的研究主要圍繞為肝細胞提供良好的長期生長代謝環(huán)境、物質(zhì)轉(zhuǎn)運交換，提高肝細胞活性和功能、反應(yīng)器體積、細胞數(shù)量等方面的研究［8-10］。然而，關(guān)于生物人工肝機器和動物安全的詳細報道甚少。

大動物實驗麻醉成功是實驗得以順利進行的前提，氯胺酮復(fù)合丙泊酚麻醉兼?zhèn)滏?zhèn)靜和鎮(zhèn)痛效果，有利于保障呼吸和循環(huán)穩(wěn)定［11-12］。整個實驗過程中，沒有行氣管插管，最終能順利完成實驗并且能夠保證動物安全。

本研究在實驗開始時及實驗4、8 h抽取動物體內(nèi)靜脈端的血，所測得的內(nèi)毒素結(jié)果均小于0．5 EU／mL，符合2004年美國真菌學(xué)研究變態(tài)反應(yīng)學(xué)家協(xié)會的透析用水及透析液標準［13］。同時，血培養(yǎng)結(jié)果顯示培養(yǎng)15 d未見細菌生長，說明在整個體外循環(huán)過程中，動物血未受到污染，整個管路、濾器密閉性良好。

實驗中始終要把動物的生命安全放在首位，實驗過程中心電圖正常，各時間點平均動脈壓、呼吸頻率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），實驗2 h心率與實驗開始時相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。心率的均數(shù)除了實驗2 h存在散點外，其余各點均在控制線內(nèi)，分析原因可能與丙泊酚的麻醉深度引起的心率下降有關(guān)。由于豬的無創(chuàng)血壓無法監(jiān)測，本文采取經(jīng)股動脈置管接壓力換能器測定有創(chuàng)血壓，顯示屏可以直接連續(xù)動態(tài)顯示收縮壓、舒張壓、平均動脈壓，動脈血壓能夠反映心臟后負荷、心肌耗氧和做功及周圍組織與器官血流灌注，是判斷循環(huán)功能的有效指標，與心率一起可以初步判定治療過程中有無內(nèi)出血、血容量不足的發(fā)生。平均動脈壓、血氧飽和度、呼吸頻率的均數(shù)無散點落在控制線外，而且波動不呈規(guī)律性變化，提示系統(tǒng)處于穩(wěn)定狀態(tài)。

在進行血液循環(huán)的過程中，人工肝機器的監(jiān)測系統(tǒng)也很重要的，特別是靜脈壓、跨膜壓、入漿壺壓的變化有很大的意義；本實驗中，以上指標除了實驗5 h與實驗開始時比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），其余各時間與實驗開始時比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。而且，除實驗5 h的均數(shù)點落在控制線外（上限外），其余各點均在控制線內(nèi)，而且波動不呈規(guī)律性變化，提示系統(tǒng)基本處于穩(wěn)定狀態(tài)。結(jié)合實驗5 h的血氧飽和度下降、心率加快、平均動脈壓下降的情況分析實驗5 h出現(xiàn)壓力值升高的原因是血漿分離器以及管路部分堵塞引起的血紅細胞數(shù)量減少。堵塞的原因可能與血流量較小、血流緩慢、肝素抗凝不足等有關(guān)。實驗中每隔2 h用250 mL生理鹽水沖洗管路和濾器，加大肝素用量后恢復(fù)到穩(wěn)定狀態(tài)。另外，實驗過程中發(fā)現(xiàn)血泵、分漿泵、倒向泵的速率設(shè)置對各個壓力的影響很大。由于血漿分離率最高為30%，分漿過快，血漿分離器達不到分漿速度，會導(dǎo)致負壓破膜，跨膜壓變?yōu)樨撝?；若分漿速度設(shè)置過慢，有可能導(dǎo)致滯留在血漿分離器的血過多，導(dǎo)致靜脈壓、跨膜壓、入漿壺壓變大，當跨膜壓、靜脈壓增加到一定程度時，也會發(fā)生破膜。本實驗所設(shè)置的血泵流量為50～60 mL／min，分漿泵流量為15 mL／min，倒向泵LDP1、LDP2流量為18 mL／min，各個壓力值平穩(wěn)，跨膜壓穩(wěn)定在40～60 mm Hg，保證了有效的分漿率。

因此，在新型生物人工肝系統(tǒng)治療過程中，生命體征處于穩(wěn)定狀態(tài)，血流動力學(xué)相對穩(wěn)定，呼吸以及循環(huán)功能未受到不良影響，人工肝機器的各個壓力監(jiān)測值趨于穩(wěn)定，動物的生命安全得以保證，在此基礎(chǔ)上，可以進一步評價豬的肝衰竭模型的有效性。

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