靶向轉(zhuǎn)化生長因子-βⅡ型受體核酸適配子結(jié)合位點預(yù)測及相關(guān)驗證研究＊

王 薇，黃陽玉，朱曉燕，陳 俠，許 多，肖 奕，謝 琳△

（1．第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所眼科，重慶400042；2．華中科技大學(xué)物理學(xué)院生物分子物理與模建小組，武漢430074）

抗青光眼濾過手術(shù)是治療原發(fā)性青光眼的主要方法之一，而濾過術(shù)后手術(shù)區(qū)的濾過通道瘢痕化是手術(shù)失敗的主要原因［1］。因此，臨床上常使用5-氟尿嘧啶、絲裂霉素等抗代謝藥物來抑制術(shù)后疤痕形成，提高手術(shù)成功率，但其無法完全避免諸如濾過泡滲漏、低眼壓、眼內(nèi)炎、角膜損傷等并發(fā)癥的發(fā)生。所以，尋求一種更為安全、有效、毒性小的藥物作用于抗青光眼術(shù)后抑制瘢痕形成仍然是目前的研究方向。瘢痕的形成與轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）的活性有著密切關(guān)系［2-3］，其中TGF-β與其Ⅱ型受體（TβRⅡ）的結(jié)合是導(dǎo)致組織瘢痕化的始動環(huán)節(jié)。因此，拮抗或者抑制TGF-β與TβRⅡ的結(jié)合，可為青光眼濾過術(shù)后抗瘢痕提供新的方法。本課題組前期應(yīng)用指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX）篩選出TβRⅡ的單鏈核酸適配子S58，并驗證了S58可對TGF-β介導(dǎo)的人Tenon囊成纖維細(xì)胞（HTFs）分化產(chǎn)生抑制作用［4］。適配子作用藥物從基礎(chǔ)轉(zhuǎn)向臨床必須在穩(wěn)定性上進(jìn)行優(yōu)化驗證，甚至需要對基團(tuán)修飾。而核酸適配子能夠識別靶分子并結(jié)合緊密是基于其三維結(jié)構(gòu)，單鏈核酸適配子結(jié)構(gòu)靈活多變，能在溶液根據(jù)靶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生適用性折疊重構(gòu)，形成幾何構(gòu)象匹配、熱力學(xué)穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，比如與靶分子形成口袋、假結(jié)等結(jié)構(gòu)［5］。因此，研究適配子S58的三維結(jié)構(gòu)是有必要的，本研究建立S58的三維模型，旨在預(yù)測S58與TβRⅡ的結(jié)合部位，并進(jìn)一步驗證S58的高親和力及特異靶向性，從而明確S58的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及特異性。

1 材料與方法

1．1 材料 本研究中所用細(xì)胞由本課題組前期原代培養(yǎng)的HTFs傳代而來［6］，取第4～10代對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。

1．2 主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、雙抗、Hanks平衡鹽溶液（美國Hyclone公司）；人重組TGF-β2蛋白（美國Peproteeh公司）；鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）單克隆抗體（美國Abcam公司）；鼠抗人單克隆β-actin抗體、辣根標(biāo)記山羊抗兔Ig G、辣根標(biāo)記山羊抗鼠Ig G（北京中杉公司）；TβRⅡ胞外段蛋白（美國Rapidbio公司），核酸適配子S58（5′-ACA TTG CTG CGT GAT CGC CTC ACA TGG GTT TGT CTG GTC GAT TTG GAG GTG GTG GGT GGC-3′）及各剪切序列均由上海生工生物工程公司進(jìn)行DNA合成。生物傳感器（美國Ther mo公司）；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜設(shè)備（美國Bio-Rad公司）；光學(xué)倒置相差顯微鏡（日本Oly mpas公司）。

1．3 方法

1．3．1 三維建模 目前沒有直接的軟件可用于預(yù)測單鏈DNA的三級結(jié)構(gòu)，本研究采用3d RNA［7］先建立RNA的三級結(jié)構(gòu)，3d RNA是一個基于RNA序列和二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測方法，再通過計算機(jī)測算翻譯突變?yōu)镈NA的三級結(jié)構(gòu)。首先應(yīng)用DNA序列轉(zhuǎn)錄成RNA序列，應(yīng)用mfold［8］軟件進(jìn)行RNA的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，再通過輸入RNA序列和二級結(jié)構(gòu)，3d RNA可以預(yù)測RNA的三級結(jié)構(gòu)。得到RNA的三級結(jié)構(gòu)之后，需要將其轉(zhuǎn)化成對應(yīng)的DNA結(jié)構(gòu)。這個過程分為兩步：（1）核苷酸突變；（2）優(yōu)化結(jié)構(gòu)。首先，對于RNA結(jié)構(gòu)中的每一個核糖核苷酸分子，用對應(yīng)的脫氧核糖核苷酸分子進(jìn)行取代，即進(jìn)行重疊操作，重疊的原子只包括堿基。通過上述的重疊操作，得到的DNA分子可能有部分共價鍵斷裂或者原子重疊，所以需要進(jìn)行結(jié)構(gòu)的優(yōu)化［9］，本研究采用amber對其進(jìn)行了優(yōu)化。TβRⅡ胞外段蛋白可以直接通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索得到晶體結(jié)構(gòu)。

1．3．2 分子對接預(yù)測結(jié)合位點 得到2個分子的三維結(jié)構(gòu)后采用Hex Server程序［10］對2個分子進(jìn)行對接。Hex Server是一個基于圖像處理的進(jìn)行蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、DNA、RNA的對接服務(wù)器。Hex Server經(jīng)過運行測算給出最有可能對接后的20個相互作用能量最低的復(fù)合物構(gòu)象。在此基礎(chǔ)上使用軟件Bind N［11］預(yù)測受體蛋白可能的結(jié)合位點，Bind N是一個基于網(wǎng)絡(luò)的根據(jù)氨基酸序列來有效預(yù)測蛋白質(zhì)的DNA、RNA結(jié)合位點工具。其預(yù)測DNA的結(jié)合殘基靈敏度為69．40%，特異度為70．47%，根據(jù)支持向量機(jī)大于0．372 5預(yù)測出24個與DNA的結(jié)合殘基位點，這樣又進(jìn)一步縮小了結(jié)合位點的范圍。最后進(jìn)一步采用分子動力學(xué)模擬方法進(jìn)行進(jìn)一步細(xì)致的分子對接。

1．3．3 適配子ss DNA與TβRⅡ的親和力檢測 采用第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院中心實驗室建立的生物傳感器技術(shù)檢測S58及各剪切的DNA與TβRⅡ的親和力大小。按照已經(jīng)建立的方法包被TβRⅡ，S58及剪切的DNA各組均采用杜氏磷酸鹽緩沖液溶解成200 mg／L，取5μL上樣，檢測與TβRⅡ的親和力［12］。

1．3．4 蛋白免疫印跡法（Wester n blot）法檢測人HTFs中α-SMA的表達(dá) 培養(yǎng)8瓶HTFs待貼壁并長至70%左右融合，將培養(yǎng)基換為無血清培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h，分別加以DMEM（DMEM對照 組）、TGF-β2、TGF-β2＋S58、TGF-β2＋S58（3′-5 bp）、TGF-β2＋S58（3′-10 bp）、TGF-β2＋S58（5′-5 bp）、TGF-β2＋S58（5′-10 bp）、TGF-β2＋S58（5′-15 bp）誘導(dǎo)HTFs 24 h，并以此分為不同的組別。各組TGF-β2濃度均為2 ng／mL，DNA濃度均為50 n mol／L；中止刺激后PBS清洗細(xì)胞3次，每次10 min，每瓶加入180μL含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，考馬斯亮藍(lán)G-2250法測定每個樣本中的蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度取30μL樣品上樣，質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行電泳。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜180 min。質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶室溫封閉膜2 h。鼠抗人α-SMA單克隆抗體按1∶200比例加入到2 mL 5%脫脂牛奶中4℃孵育膜過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，辣根標(biāo)記山羊抗鼠Ig G按1∶5 000比例加入到2 mL 5%脫脂牛奶中室溫孵育2 h，TBST洗膜3次。發(fā)光液作用于膜上，暗室內(nèi)曝光，觀察X線片上的條帶，掃描后保存，Quantity One 4．6．2軟件（美國Bio Rad公司）計算出膠片上各蛋白條帶灰度值，計算出α-SMA相對表達(dá)量，并作出柱狀圖。

1．4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13．0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以±s表示，組間差異比較采用單因素方差分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 適配子ss DNA S58及TβRⅡ胞外段的三維模型 RNA預(yù)測為一個帶發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNA，轉(zhuǎn)換成單鏈DNA時，DNA自身適應(yīng)性互補(bǔ)形成局部雙螺旋結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中搜索得到TRβⅡ胞外段蛋白1PLO，由122個氨基酸組成，有10種自然態(tài)結(jié)構(gòu)，并且是以二聚體結(jié)構(gòu)存在。比對TGF-β與其受體的復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)，找到10種自然態(tài)中最接近與配體結(jié)合時的結(jié)合態(tài)結(jié)構(gòu)1PLO-3，其結(jié)構(gòu)緊密，包括了9個β折疊。見圖1。

圖1 適配子ss DNA S58（左）及TβRⅡ胞外段（右）的三維結(jié)構(gòu)

2．2 適配子ss DNA S58及TβRⅡ胞外段蛋白的分子對接 人為去掉DNA 3′端游離的5個堿基及受體蛋白兩端游離氨基酸部位，將優(yōu)化后的S58結(jié)構(gòu)與TβRⅡ胞外段蛋白進(jìn)行分子對接，得到10個相互作用能量最低的對接構(gòu)象，相互作用能量包括2個分子之間的靜電力和范德華力，可以間接反映適配子DNA與TβRⅡ胞外段蛋白的結(jié)合情況，相互作用的能量越低，結(jié)合則越穩(wěn)定。因此選擇最低能量-502．65 kJ／mol的對接構(gòu)象，見圖2。對接位置位于DNA的中間部位，運用Cocomaps軟件分析，使用8?作為定義結(jié)合殘基的距離閾值，即對于復(fù)合物中核酸的某個氨基酸殘基，如果其包含的至少一個原子與復(fù)合物中核酸序列的任何一個原子間的距離小于8?，那么這個氨基酸殘基為核苷酸-結(jié)合殘基。相對應(yīng)的核酸結(jié)合位點分別包括位點Ⅰ（T4、T5、G6、C7）、位點Ⅱ（G13、A14、T15、C16、G17、C18）、位點Ⅲ（T31、G32、T33、C34）及位點Ⅳ（G40、A41、T42、T43、T44、G45、G46）。

圖2 適配子ss DNA S58與TβRⅡ胞外段對接位點

2．3 剪切S58與親和力檢測 根據(jù)S58與TβRⅡ胞外段的結(jié)合位于DNA中間部位，采取分別從DNA兩端逐步剪切堿基，每次剪切5 bp。S58與TβRⅡ胞外段的結(jié)合力最強(qiáng)，其次為S58-5即3′端剪切5 bp，但不論從5′端還是3′端開始剪切DNA S58，得到的結(jié)構(gòu)修飾后DNA親和力與S58相比均沒有明顯增加，反而有所下降。見圖3。

圖3 S58-1～7與TβRⅡ胞外段的結(jié)合力檢測

2．4 結(jié)構(gòu)優(yōu)化后DNA作用下細(xì)胞α-SMA的表達(dá)變化 α-SMA是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，是瘢痕收縮的物質(zhì)基礎(chǔ)。TGF-β2組刺激HTFs后α-SMA表達(dá)較DMEM對照組明顯增加（P＜0．001），TGF-β2＋S58組刺激HTFs后α-SMA表達(dá)較TGF-β2組明顯降低（P＜0．001），所有結(jié)構(gòu)優(yōu)化后的DNA中只有TGF-β2＋S58（3′-5 bp）組較TGF-β2組α-SMA表達(dá)有明顯降低（P＜0．001），但其降低程度不如TGF-β2＋S58組，其他組與TGF-β2組比較α-SMA表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），見圖4。

圖4 各實驗組刺激下HTFs表達(dá)α-SMA的變化

3 討 論

適配子在眼科方面已經(jīng)有很大進(jìn)展，目前許多研究顯示適配子如貝伐單抗、寡聚核RNA-寡聚苷酸、培加尼布等能通過抑制血管內(nèi)皮生長因子作用從而明顯降低眼部的血管形成。哌加他尼鈉是第一個通過美國食品與藥品管理局認(rèn)證用于治療年齡相關(guān)性黃斑變性的核酸適配子藥物［13］，還有其他治療眼部新生血管的適配子藥物在臨床實驗中。因此，能封阻TβRⅡ降低青光眼術(shù)后濾過區(qū)纖維化形成的適配子S58成為新的研究切入點。適配子應(yīng)用于臨床治療的優(yōu)點在于其親和力高、穩(wěn)定性好、易人工合成。所有的適配子能發(fā)揮高效、特異的作用，基于其特殊的、穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)，與靶分子特異的作用位點結(jié)合，且具有較高的親和力［14］，所以，研究適配子與靶分子的結(jié)合位點及結(jié)合力是解釋適配子發(fā)揮生物效應(yīng)的理論根據(jù)，并且進(jìn)一步驗證適配子的穩(wěn)定性可為適配子運用于臨床藥物提供理論依據(jù)。

隨著計算機(jī)技術(shù)的飛速發(fā)展，計算機(jī)技術(shù)輔助研究蛋白質(zhì)和核酸的相互作用成為當(dāng)下的熱點，特別是在藥物分子的篩選和設(shè)計方面已經(jīng)有很大進(jìn)展［15］。其中分子對接是針對研究配體與受體分子之間的相互作用，基于結(jié)合的復(fù)合物構(gòu)象，預(yù)測其結(jié)合模式與親和力的一種重要理論方法。Luscombe等［16］利用氨基酸序列的保守性構(gòu)建計算機(jī)算法來預(yù)測蛋白質(zhì)／DNA復(fù)合體中DNA的結(jié)合位點。研究2個分子的結(jié)合位點，首先需要建立2個分子的三維結(jié)構(gòu)。寡核苷酸適配子在溶液中可以形成假結(jié)、發(fā)夾、凸環(huán)、G-四分體等三維空間結(jié)構(gòu)，通過氫鍵、范德華力、疏水堆積作用等與靶分子緊密結(jié)合。有研究表明，適配子與靶分子的結(jié)合是相互誘導(dǎo)的適應(yīng)性識別，當(dāng)靶分子存在時，單鏈DNA或RNA發(fā)生適應(yīng)性折疊，與靶分子相互識別［17］。本實驗中適配子S58即為60個堿基的寡核苷酸，與靶受體蛋白作用時遵循“鎖鑰原理”，發(fā)生適應(yīng)性自身堿基互補(bǔ)情況，且DNA帶負(fù)電荷，在與靶受體蛋白結(jié)合時會向帶正電荷的堿性氨基酸靠近，DNA分子的靈活性使其能夠形成的結(jié)構(gòu)千變?nèi)f化，單鏈DNA有局部自互補(bǔ)的情況，由于適配子的結(jié)構(gòu)特殊性，其三維結(jié)構(gòu)預(yù)測往往需要從二級結(jié)構(gòu)著手，因此DNA的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測有一定難度。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可以通過蛋白質(zhì)晶體學(xué)得到或者從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中找到其已知的結(jié)構(gòu)，正如本實驗中的TβRⅡ胞外段蛋白結(jié)構(gòu)。分子對接的結(jié)果表明，DNA與TβRⅡ胞外段蛋白的結(jié)合位點均在空間結(jié)構(gòu)上與受體相靠近或與受體存在氫鍵相互作用，這些位點在配體與受體結(jié)合、定位和水解過程中可能發(fā)揮重要作用，實驗從適配子S58的三維建模研究切入，合理地運用大量目前廣泛得到認(rèn)可成功率較高的建模、分子對接軟件，在理論上較為準(zhǔn)確地預(yù)測到適配子S58與TβRⅡ胞外段蛋白的結(jié)合位點，極大地減少可能的結(jié)合位點數(shù)量，為進(jìn)一步實驗提供指導(dǎo)。

生物傳感器是從分子水平檢測生物分子活性力的技術(shù)手段，其檢測快速、靈敏度高、選擇性強(qiáng)，近年來在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用越來越廣泛，特別是針對核酸與蛋白質(zhì)的作用檢測，Mccauley等［18］研制了基于蛋白芯片基礎(chǔ)的適體生物傳感器來對蛋白進(jìn)行分析鑒定，這種傳感器可以固定著針對不同蛋白質(zhì)的DNA和RNA適體。本實驗也運用生物傳感性針對TβRⅡ胞外段蛋白，根據(jù)計算機(jī)預(yù)測的核酸適配子與TβRⅡ胞外段蛋白的結(jié)合位點提示5′端剪切掉5 bp會影響到結(jié)合位點Ⅰ（T4、T5、G6、C7），故5′端剪切進(jìn)一步驗證剪切后DNA S58～4與TβRⅡ胞外段蛋白的親和力是下降的，細(xì)胞水平上也對TGF-β2刺激后的HTFs表達(dá)α-SMA無明顯抑制作用，這與計算機(jī)預(yù)測的結(jié)果相符。又因為SELEX技術(shù)在篩選過程中是必須應(yīng)用大容量的隨機(jī)寡核苷酸文庫，大約在1 010個隨機(jī)RNA序列中才有一個序列與靶分子特異結(jié)合［18］，且核酸文庫中是由中間為一定長度的隨機(jī)序列和5′、3′端的固定序列構(gòu)成，固定序列是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及其他酶學(xué)反應(yīng)相關(guān)引物的結(jié)合位點。因此，推測剪切掉的5′端序列是帶有限制性內(nèi)切酶位點的固定序列。但當(dāng)同時選擇剪切3′端序列時，當(dāng)剪切掉5 bp時，DNA與TβRⅡ胞外段蛋白親和力有所下降，盡管能抑制TGFβ2刺激后HTFsα-SMA的表達(dá)，但實驗組α-SMA的表達(dá)仍較S58組強(qiáng)，抑制TGF-β2介導(dǎo)的HTFS轉(zhuǎn)分化作用是較S58減弱的，并且在剪切3′端非預(yù)測的結(jié)合位點后，適配子與TβRⅡ胞外段蛋白親和力同樣也下降。推測因單鏈核苷酸在不同的溶液、p H、溫度等因素下易形成多種空間構(gòu)象，特別在剪切掉適配子序列后極有可能改變核苷酸局部的結(jié)構(gòu)，從而無法與靶向TβRⅡ胞外段蛋白質(zhì)的關(guān)鍵作用位點結(jié)合。因此，進(jìn)一步論證了S58為靶向TβRⅡ的特異性分子，結(jié)構(gòu)上具有高度穩(wěn)定性，任何結(jié)構(gòu)的改變均會降低與TβRⅡ的親和力，為S58的體內(nèi)實驗提供了明確的理論基礎(chǔ)。

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