Eotaxin在鼻腔分泌物中的表達(dá)及意義

蘭 寧，徐 紅

（南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，南昌330000）

鼻息肉是耳鼻咽喉科常見的鼻部慢性病之一，可發(fā)生在任何的社會階層及種族之間，發(fā)病率為1%～2%，男女之比為2～4∶1，多見于20歲以后的成年人［1］。雖然目前對鼻息肉的發(fā)病機制還不是很明確，但嗜酸性粒細(xì)胞作為鼻息肉最主要的組織學(xué)特點，其相關(guān)因子都是近幾年研究的熱點。本文就鼻息肉、慢性鼻竇炎、鼻中隔偏曲患者鼻腔分泌物中嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子eotaxin濃度比較來探討eotaxin在鼻息肉疾病發(fā)生、發(fā)展中所起的作用及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 共選取40例患者鼻腔分泌物，其中15例為鼻息肉患者，15例為慢性鼻竇炎患者，10例為單純鼻中隔偏曲患者。女17例，男23例，年齡18～50歲。所有患者均來源于本院住院部2012年7～9月的患者，所選患者入院時均經(jīng)過鼻內(nèi)窺鏡及副鼻竇CT檢查確診為鼻息肉、慢性鼻竇炎或單純鼻中隔偏曲。鼻息肉、慢性鼻竇炎患者術(shù)后病理也得到證實。所選患者1個月前全身或局部均未使用抗生素、抗組胺藥、皮質(zhì)類固醇激素，術(shù)前均通過血清學(xué)檢測IgG、IgE，皮膚點刺試驗以排除過敏性鼻炎。所選患者均哮喘、寄生蟲病等過敏反應(yīng)性疾病病史。

1.2 標(biāo)本采集 所選患者入院后在鼻內(nèi)窺鏡下通過負(fù)壓吸引法收集鼻腔分泌物1mL，所有標(biāo)本用PBS緩沖液稀釋10倍，混勻，4 000r／min離心10min，細(xì)胞等有形成分沉入管底，取1mL上清液置于離心塑料管，放于-20℃冰箱保存待用。

1.3 實驗方法 用人eotaxin定量酶聯(lián)免疫測定試劑盒，購于武漢優(yōu)爾生科技公司。嚴(yán)格按照試劑說明書操作，實驗結(jié)束后在波長為450nm的酶標(biāo)儀中檢測得出標(biāo)準(zhǔn)品及每個標(biāo)本的OD值，使用CurveExpert 1.4系統(tǒng)繪出七點圖并算出每份標(biāo)本的eotaxin濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

鼻息肉患者鼻腔分泌物eotaxin的平均濃度為（468.82±440.64）pg／mL，慢性鼻竇炎患者鼻腔分泌物eotaxin的平均濃度為（443.85±334.68）pg／mL，單純鼻中隔偏曲患者eotaxin的平均濃度為（149.23±49.01）pg／mL。鼻息肉、慢性鼻竇炎患者鼻腔分泌物eotaxin濃度均高于鼻中隔偏曲患者鼻腔分泌物eotaxin濃度，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝2.26、2.74，P＜0.05），但鼻息肉、慢性鼻竇炎鼻腔分泌物eotaxin濃度之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t＝0.17，P＞0.05），見表1。

表1 40例患者鼻腔分泌物中eotaxin濃度比較（±s）

表1 40例患者鼻腔分泌物中eotaxin濃度比較（±s）

a：P＜0.05，與鼻中隔偏曲組比較。

組別 n eotaxin（pg／mL）鼻息肉組 15 468.82±440.64a鼻中隔偏曲組 10 149.23±49.01慢性鼻竇炎組 15 443.85±334.68a

3 討 論

Eotaxin最早于致敏豚鼠的支氣管肺泡灌洗液中分離獲得［2］，屬于C-C類化學(xué)趨化因子，目前發(fā)現(xiàn)eotaxin家族有eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3，雖然它們之間的結(jié)構(gòu)不同，但它們的功能相似，都對嗜酸性粒細(xì)胞具有趨化作用。Eotaxin主要來源為上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和活化的白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，然而，在鼻息肉組織的炎性反應(yīng)中滲出性巨噬細(xì)胞和EOS在某種程度上都是eotaxin的主要來源，使eotaxin生成增加［3］。eotaxin主要作用于CCR3受體上，與CCR3受體特異性的結(jié)合促進嗜酸性粒細(xì)胞經(jīng)內(nèi)皮遷移至鼻息肉黏膜的固有層，對嗜酸性粒細(xì)胞產(chǎn)生特異性的趨化作用。eotaxin不僅與嗜酸性粒細(xì)胞炎癥關(guān)系密切，還與其他炎性細(xì)胞（T淋巴細(xì)胞，堿性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞等）的趨化或活化有關(guān)，但由于CCR3受體在嗜酸性粒細(xì)胞上大量存在，因此eotaxin與嗜酸性粒細(xì)胞有高度的親和性。雖然對嗜酸性粒細(xì)胞具有趨化作用的細(xì)胞因子不止eotaxin，還有IL-5、白三烯B4、血小板衍生生長因子等，其中IL-5是EOS家族最具特異性及對EOS選擇性終端分化負(fù)責(zé)的細(xì)胞因子，同時IL-5也能刺激EOS從骨髓釋放到外周循環(huán)中［4］。但與其他作用于嗜酸性粒細(xì)胞的細(xì)胞因子相比，eotaxin是一種表現(xiàn)出對嗜酸性粒細(xì)胞遷移更高選擇性的趨化因子。Toru Yao等發(fā)現(xiàn)在嗜酸性粒細(xì)胞鼻息肉中eotaxin濃度比非嗜酸性粒細(xì)胞鼻息肉中eotaxin濃度明顯增加，進一步指出在鼻息肉組織中嗜酸性粒細(xì)胞的募集是一個自我放大的過程［5］。

CCR3最早從單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞克隆而來，屬于G蛋白耦聯(lián)受體家族。它主要表達(dá)在嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和TH2細(xì)胞，介導(dǎo)遷移及脫顆粒反應(yīng)。CCR3是一種非特異性趨化因子受體，可與多種趨化因子結(jié)合發(fā)生作用，包括eotaxin、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3、RANTES等。趨化因子與CCR3結(jié)合后可產(chǎn)生一系列生化反應(yīng)，選擇性促進嗜酸性粒細(xì)胞募集浸潤到炎癥部位。Bryan等［6］研究發(fā)現(xiàn)，eotaxin可通過與CCR3的結(jié)合可誘導(dǎo)部分CCR3內(nèi)陷和嗜酸性粒細(xì)胞變形，有助于嗜酸性粒細(xì)胞的活化和遷移。

Eotaxin最早于致敏豚鼠的支氣管肺泡灌洗液中分離獲得，指出eotaxin在氣道疾病中起了一定的作用。既然eotaxin能在支氣管肺泡灌洗液中發(fā)現(xiàn)，作者也能假設(shè)在鼻息肉患者的鼻腔分泌物中分離獲得。鑒于這個假設(shè)及獲取鼻腔分泌物法與血清及鼻息肉勻漿組織法相比具有無創(chuàng)性，簡便性、費用低、隨訪性高等特點，根據(jù)先前學(xué)者文獻(xiàn)資料提供提取鼻腔分泌物的辦法及自己的臨床實驗尋找到一種方便、簡單的負(fù)壓吸引法（將嬰兒吸痰管一端接負(fù)壓裝置，一端接吸引器，通過鼻內(nèi)窺鏡將鼻腔分泌物吸入儲留瓶中保存）此法時間短，有效減輕患者的痛苦，費用低，提取量充足。避免了明膠海綿填塞法的時間長，提取量少等缺點，也避免了鼻腔灌洗法的患者配合不佳、稀釋倍數(shù)計算不精確等缺點。實驗結(jié)果顯示鼻息肉、慢性鼻竇炎患者鼻腔分泌物eotaxin濃度比鼻中隔患者鼻腔分泌物eotaxin濃度顯著增加（P＜0.05），表明通過提取鼻息肉、慢性鼻竇炎、鼻中隔偏曲患者的鼻腔分泌物經(jīng)ELISA實驗來檢測鼻腔分泌物中eotaxin濃度的方法是具有可行性的。避免了免疫組織化學(xué)法及RT-PCR法時間長、費用高、操作復(fù)雜等特點，是個值得在臨床上推廣的方法。

Shin等［7］用原位雜交方法檢測顯示鼻息肉組織與正常下鼻甲組織中eotaxin基因的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Hiroyuki Seto等［8］通過免疫組織化學(xué)法可發(fā)現(xiàn)在正常上頜竇黏膜組織中少量的eotaxin蛋白陽性細(xì)胞，但在鼻息肉組織固有層中可見大量的eotaxin蛋白陽性細(xì)胞。OIze等［9］通過免疫組化方法研究顯示，eotaxin家族的eotaxin、eotaxin-2、eotaxin-3蛋白在鼻息肉組織中的表達(dá)明顯高于正常下鼻甲組織，且3者蛋白水平與組織中EOS數(shù)量呈正相關(guān)。國內(nèi)學(xué)者用免疫組化和RT-PCR從蛋白和基因兩個水平檢測鼻息肉組織和正常下鼻甲中的eotaxin的表達(dá)，結(jié)果顯示兩者間蛋白表達(dá)量為（18.56±3.59）和（0.97±0.11）；兩組 mRNA 表達(dá)水平為（1.02±0.193）與（0.19±0.126），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）［10］。Chao等［11］使用 ELISA 試驗檢測亞洲人慢性鼻竇炎、鼻息肉患者的血清中eotaxin比健康對照組的血清eotaxin明顯的提高（P＜0.01），表明趨化因子與疾病的炎癥程度具有密切的相關(guān)性。而本次實驗結(jié)果得出鼻息肉患者鼻腔分泌物eotaxin濃度為（468.82±440.64）pg／mL，慢性鼻竇患者鼻腔分泌物eotaxin濃度為（443.85±334.68）pg／mL，鼻中隔偏曲患者鼻腔分泌物eotaxin濃度為（149.23±49.01）pg／mL。鼻息肉、慢性鼻竇炎患者鼻腔分泌物eotaxin濃度比鼻中隔偏曲患者鼻腔分泌物eotaxin濃度顯著升高（P＜0.05），這與先前文獻(xiàn)得出的鼻息肉患者比健康對照組eotaxin量顯著增加的結(jié)論是一致的。

雖然目前對eotaxin研究的文獻(xiàn)不少，但通過使用ELISA方法檢測鼻腔分泌物中eotaxin濃度的方法還是很少的，本研究結(jié)果得出鼻息肉組、慢性鼻竇炎組鼻腔分泌物eotaxin濃度均高于鼻中隔偏曲組鼻腔分泌物eotaxin濃度，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步說明eotaxin在鼻息肉疾病發(fā)生、發(fā)展中所起重要作用，本實驗不足之處在于并沒有對eotaxin家族eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3在鼻息肉發(fā)病的不同時期所起的作用進行研究，鑒于eotaxin家族eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3在哮喘不同時期所起的作用不同，今后也可在這方面進行研究。之前有研究也發(fā)現(xiàn)CCR3在以嗜酸性粒細(xì)胞聚集為主的變態(tài)反應(yīng)性疾病中同樣也起了重要作用，如：哮喘，變應(yīng)性鼻炎等。Joubert等［12］發(fā)現(xiàn)，eotaxin作用于氣道平滑肌細(xì)胞CCR3可誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞遷移和增殖，使細(xì)胞內(nèi)Ca2＋增高，哮喘患者支氣管黏膜中CCR3mRNA表達(dá)增加。而目前臨床上廣泛使用CCR3拮抗劑治療哮喘及變應(yīng)性鼻炎，如抗CCR3單克隆抗體已是目前最具有研究價值的藥物，它通過有效的抑制嗜酸性粒細(xì)胞在局部組織的募集從而在變應(yīng)性鼻炎中發(fā)揮重要作用。這為今后進一步研究CCR3拮抗劑治療鼻息肉提供了一定的理論依據(jù)。

［1］Settipane GA.Epidemiology of nasal polyps［J］.Allergy Asthma Proc，1996，17（5）：231-236.

［2］周錦川，朱瑾.Eotaxin原核表達(dá)載體的構(gòu)建及初步表達(dá)［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2006，19（8）：678-681.

［3］Fan GK，Wang H，Takenaka H.Eosinophil infiltration and activation in nasal polyposis［J］.Acta Otolaryngol，2007，127（5）：521-526.

［4］張羅，韓德明，周兵.鼻息肉中嗜酸性粒細(xì)胞浸潤和活化與IL-5的關(guān)系［J］.中國耳鼻咽喉頭頸外科，2005，12（3）：171-174.

［5］Yao T，Kojima Y，Koyanagi A，et al.Eotaxin-1，-2，and-3 Immunoreactivity and Protein Concentration in the Nasal Polyps of Eosinophilic Chronic Rhinosinusitis Patients［J］.Laryngoscope，2009，119：1053-1059.

［6］Bryan SA，Jose PJ，Topping JR，et al.Responses of leukocytes to chemokines in whole blood and their antagonism by novel CC-chemokine receptor 3antagonists［J］.Am J Respir Crit Care Med，2002，165（12）：1602-1609.

［7］Shin SH，Park JY，Jeon CH，et al.Quantitative analysis of eotaxin and RANTES messenger RNA in nasal polyps：association of tissue and nasal eosinophils［J］.Laryngoscope，2000，110（8）：1353-1357.

［8］Seto H，Suzaki H，Shioda S.Immunohistochemical localization of eotaxin immunoreactivity in Nasal Polyps［J］.Acta Otolaryngol，2004，553：99-104.

［9］OIze H，F(xiàn)orsterU，Zuberbier T，et al.Eosinophilic nasal polyps are a rich source of eotaxin，eotaxin-2and eotaxin-3［J］.Rhinology，2006，44（2）：145-150.

［10］王曉強，康健.白介素5和趨化因子eotaxin在鼻息肉中的表達(dá)及其意義［J］.陜西醫(yī)學(xué)雜志，2010，39（6）：649-651.

［11］Chao PZ，Chou CM，Chen CH.Plasma RANTES and eotaxin levels are correlated with the severity of chronic rhinosinusitis［J］.Eur Arch Otorhinolaryngol，2012，269（11）：2343-2348.

［12］Joubert P，Lajoie-Kadoch S，LabontéI，et al.CCR3expression and function in asthmatic airway smooth muscle cells［J］.J Immunol，2005，175（4）：2702-2708.