內(nèi)皮祖細(xì)胞與粥樣斑塊穩(wěn)定性研究進(jìn)展

吳倩倩 方濤 綜述 齊國先 審校

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，遼寧沈陽 110001)

動脈粥樣硬化多見于40歲以上男性和絕經(jīng)后女性，是一種慢性進(jìn)展的炎性疾病，由內(nèi)皮損傷、炎性細(xì)胞浸潤、脂質(zhì)代謝紊亂、神經(jīng)血管功能失調(diào)等原因引起，表現(xiàn)為大、中動脈內(nèi)膜出現(xiàn)含有膽固醇、類脂等的黃色物質(zhì)，常導(dǎo)致急性心肌梗死、充血性心力衰竭、血栓形成、局部供血障礙等并發(fā)癥，給人民健康帶來很大威脅，是老年人的主要死亡原因。粥樣硬化斑塊引起并發(fā)癥與斑塊內(nèi)新生血管密度增加密切相關(guān)[1]，新生血管可增加炎性細(xì)胞浸潤及斑塊內(nèi)出血(intraplaque hemorrhage，IPH)風(fēng)險，促進(jìn)粥樣斑塊由穩(wěn)定性向不穩(wěn)定性轉(zhuǎn)變，最終導(dǎo)致斑塊糜爛或破裂。由骨髓衍生的內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，一方面通過促進(jìn)再內(nèi)皮化恢復(fù)血管受損內(nèi)皮的完整性，抑制早期階段粥樣斑塊形成;另一方面可促進(jìn)缺血缺氧部位的血管新生，增加斑塊不穩(wěn)定性。EPCs對粥樣斑塊形成及發(fā)展均產(chǎn)生影響，且在不同疾病階段作用不同。本文將深入探討EPCs與滋養(yǎng)血管的關(guān)系及對動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響。

1 滋養(yǎng)血管新生與動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性

冠狀動脈滋養(yǎng)血管來源于血管外膜，包括小動脈和小靜脈的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。顯微CT(micro computed tomography，mCT)等顯像技術(shù)表明，滋養(yǎng)血管有二級結(jié)構(gòu)，一級結(jié)構(gòu)起源于冠狀動脈，延血管外膜縱向走形，二級結(jié)構(gòu)為一級結(jié)構(gòu)的分支，繞血管壁形成環(huán)形血管束[2]。在正常生物體內(nèi)，血管壁的外膜由滋養(yǎng)血管供應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)，內(nèi)膜由腔內(nèi)氧彌散維持，未發(fā)現(xiàn)環(huán)形血管束。疾病情況下，血管內(nèi)膜增厚，氧彌散功能障礙，結(jié)果滋養(yǎng)血管代償形成環(huán)形血管束，滿足血管壁營養(yǎng)需求。當(dāng)供氧及營養(yǎng)物質(zhì)得到滿足后，滋養(yǎng)血管新生被抑制。

1.1 血管新生過程

血管新生是已有血管發(fā)芽生成新血管的過程，這一過程與血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖相關(guān)。胚胎發(fā)育過程伴隨著血管發(fā)生及心血管系統(tǒng)的建立，出生后除傷口愈合，女性月經(jīng)周期及一些病理過程(如癌癥)外，很少出現(xiàn)血管新生。在器官移植、炎癥、組織缺氧以及其他刺激下，促血管生成因子分泌增多，與抑制血管生成因子之間的平衡打破，從而啟動血管新生的過程。首先，內(nèi)皮細(xì)胞表面血管新生相關(guān)受體被激活;其次，活化的內(nèi)皮細(xì)胞釋放蛋白酶及纖溶酶以降解細(xì)胞外基質(zhì);隨后內(nèi)皮細(xì)胞遷移增殖形成萌芽結(jié)構(gòu)，芽狀結(jié)構(gòu)擴(kuò)大成環(huán)形，最終形成完整的血管腔[3]。

1.2 斑塊內(nèi)缺氧及炎癥反應(yīng)刺激血管新生

粥樣硬化斑塊的進(jìn)展以炎癥及內(nèi)膜增厚為特征。在主動脈弓及股動脈粥樣斑塊處，使用氧氣微電極檢測發(fā)現(xiàn)，從血管外膜到中層含氧量呈明顯的梯度改變，分別為50 mm Hg(1 mm Hg=0.133 3 kPa)、0 ～15 mm Hg，直接證實氧氣含量與內(nèi)膜厚度負(fù)相關(guān)[4]。內(nèi)膜增厚(超過100 μm)導(dǎo)致內(nèi)膜到管腔的距離增加，影響氧氣彌散，減少斑塊內(nèi)氧氣供應(yīng)[5]。在炎癥因子刺激下，斑塊內(nèi)細(xì)胞代謝活躍，氧耗增加，局部呈現(xiàn)缺氧狀態(tài)。因此斑塊厚度與斑塊內(nèi)炎性反應(yīng)是斑塊缺氧的重要因素，當(dāng)含氧量＜10 mm Hg(正常值20～100 mm Hg)，即供氧失衡后，缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)激活，上調(diào)多種促血管新生因子的轉(zhuǎn)錄及翻譯，如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，從而促進(jìn)新生血管形成[6]。粥樣斑塊進(jìn)展期脂質(zhì)沉積，增加巨噬細(xì)胞浸潤，刺激血管新生因子釋放，形成炎癥-缺氧-血管生成的惡性循環(huán)。

1.3 新生血管易引發(fā)斑塊內(nèi)出血導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定

隨著年齡的增加及心血管危險因素的影響，粥樣斑塊形成并緩慢發(fā)展，逐漸加重形成不穩(wěn)定斑塊，最終斑塊破裂引發(fā)嚴(yán)重并發(fā)癥。1999年Moulton等就血管生成抑制劑TNP-470和endostatin作用于動脈粥樣硬化動物模型，載脂蛋白基因敲除小鼠(apoE－/－mice)經(jīng)過16周的治療后，TNP-470和endostatin治療組的斑塊面積均比對照組顯著縮小，兩者對斑塊增生的抑制率分別高達(dá)85%和70%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;而治療組和對照組的血液膽固醇水平和血管內(nèi)膜斑塊內(nèi)的平滑肌細(xì)胞的數(shù)量無統(tǒng)計學(xué)差異。Moulton等[7]第一次從治療的角度直接證實了血管新生是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。2010年Hellings等[1]研究顯示，患者斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤、脂質(zhì)核增大、鈣化、膠原、平滑肌細(xì)胞數(shù)量與疾病結(jié)局無關(guān)，而斑塊出血和斑塊內(nèi)血管密度增加是斑塊破裂的獨(dú)立危險因子，與疾病預(yù)后密切相關(guān)。

IPH為紅細(xì)胞從新生血管外滲到斑塊內(nèi)的過程。有三個原因可以解釋紅細(xì)胞外滲:新生血管周圍無周圍細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞支撐，相對脆弱;微血管內(nèi)皮之間很少形成縫隙連接，通透性增加;新生血管缺乏完整的基底膜結(jié)構(gòu)[8]。另外新生血管缺乏細(xì)胞外基質(zhì)支撐也可能與紅細(xì)胞外滲有關(guān)。新生血管破裂引起斑塊內(nèi)出血，紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板和血漿蛋白進(jìn)入斑塊內(nèi)。紅細(xì)胞細(xì)胞膜中含有40%膽固醇，遠(yuǎn)高于其他細(xì)胞，外滲到斑塊內(nèi)，經(jīng)過分解代謝，形成斑塊內(nèi)膽固醇結(jié)晶，因而IPH是斑塊內(nèi)脂質(zhì)核擴(kuò)大的主要原因[8]。紅細(xì)胞外滲后，細(xì)胞膜分解釋放游離血紅素，通過氧化應(yīng)激反應(yīng)形成高價鐵離子(Fe3+)，影響斑塊穩(wěn)定性。白細(xì)胞及血小板外滲，促進(jìn)斑塊內(nèi)局部炎癥反應(yīng)，增加巨噬細(xì)胞及EPCs等浸潤。這些因素共同作用加重斑塊負(fù)擔(dān)，促進(jìn)粥樣斑塊快速進(jìn)展，由穩(wěn)定狀態(tài)向不穩(wěn)定狀態(tài)轉(zhuǎn)變[9]。

2 EPCs與滋養(yǎng)血管新生

EPCs又名血管母細(xì)胞 (angioblasts)，分布于骨髓和外周血中，并可定居于血管外膜。目前由表面表達(dá)的 3 種標(biāo)記:CD133+、CD34+、VEGFR+識別[10]，尚無EPCs的準(zhǔn)確定義。從最初具有極度活躍的增殖能力，經(jīng)歷連續(xù)的分化階段，逐漸失去有絲分裂能力，分化形成成熟內(nèi)皮細(xì)胞，同時祖細(xì)胞特征性CD133表達(dá)減弱，細(xì)胞黏附因子表達(dá)增強(qiáng)，獲得內(nèi)皮細(xì)胞特性，如攝取低密度脂蛋白及釋放一氧化氮(NO)。EPCs被視為有促進(jìn)血管內(nèi)皮再生和缺血組織血管新生功能的祖細(xì)胞。有研究表明CD133+EPCs有促進(jìn)血管新生作用，而 CD133－EPCs則無此作用[11]。

循環(huán)EPCs數(shù)量及功能在不同的個體及疾病狀態(tài)存在明顯差異。粥樣硬化危險因素影響循環(huán)EPCs的數(shù)量及功能，心血管危險因素包括:糖尿病、高血壓、吸煙、高脂血癥等，存在這些高危因素的患者中，循環(huán)EPCs的數(shù)量減少，功能缺失[12]。粥樣硬化危險因素可導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂，而受損內(nèi)皮再內(nèi)皮化以保持內(nèi)皮完整性的能力下降，是動脈粥樣硬化形成的前提。粥樣硬化是一種慢性進(jìn)展的炎性疾病，如前已闡明，炎癥因子與血管新生關(guān)系密切，在斑塊發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用，那么炎癥是否會影響EPCs的數(shù)量及功能?誠然，斑塊內(nèi)局部炎癥反應(yīng)增加血管新生，但是在慢性系統(tǒng)性炎癥疾病中，C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)含量增高，削弱EPCs存活及分化功能，從而影響缺血區(qū)域血管新生能力。CRP同時作為預(yù)測心血管疾病的指標(biāo)，可以看做炎癥與心血管疾病發(fā)生的紐帶[13]。Padfield 等[14]則表示:在急性血管損傷后，全身炎癥反應(yīng)引起非特異性的造血祖細(xì)胞動員，但并非EPCs動員的特異性刺激，因此認(rèn)為全身炎癥反應(yīng)與EPCs無特殊關(guān)聯(lián)。Ajijola等[15]研究表明，在小鼠模型中，規(guī)律跑步鍛煉可以下調(diào)炎癥因子水平且上調(diào)EPCs數(shù)量。循環(huán)EPCs數(shù)量還與患者長期用藥、體內(nèi)某些激素水平及血小板活化等都有密切關(guān)系。因此認(rèn)為EPCs數(shù)量及功能受多種因素調(diào)控，粥樣硬化患者雖大都存在心血管疾病高危因素，可減少EPCs數(shù)量及功能，但隨著體育鍛煉及體內(nèi)激素水平變化等多種因素影響，在疾病各個階段，EPCs數(shù)量多少不一而同。

EPCs參與血管內(nèi)皮動態(tài)平衡及細(xì)胞修復(fù)過程，因此影響疾病早期斑塊的發(fā)生。在生理情況下，血管單層內(nèi)皮細(xì)胞的完整性依賴于EPCs歸巢，刺激臨近成熟內(nèi)皮細(xì)胞增殖，取代凋亡內(nèi)皮細(xì)胞，從而促進(jìn)受損血管再內(nèi)皮化，保護(hù)血管內(nèi)皮完整性[16]。有實驗表明，循環(huán)血中EPCs減少是粥樣硬化疾病早期階段的獨(dú)立指標(biāo)，在血管損傷模型中，直接靜脈輸入EPCs可減少新生內(nèi)膜形成[17-18]。因此在粥樣硬化發(fā)生早期，EPCs促進(jìn)單層內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)，抑制粥樣斑塊發(fā)展。然而隨著年齡的增加和心血管病危險因素的影響，血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激增加，EPCs數(shù)量及功能降低，導(dǎo)致內(nèi)皮完整性遭到破壞，進(jìn)而炎癥細(xì)胞浸潤及脂質(zhì)沉積增加，粥樣斑塊形成;同時加重局部炎癥反應(yīng)及缺氧程度，誘導(dǎo)斑塊內(nèi)新生血管形成。

隨著研究的深入，越來越多的實驗結(jié)果證實:EPCs不僅參與胚胎時期血管的發(fā)生，同樣參與到出生后血管新生過程中。EPCs經(jīng)周圍微環(huán)境刺激從骨髓處動員，在趨化因子作用下募集至缺血組織或受損內(nèi)皮處，促進(jìn)缺血區(qū)域血管新生。EPCs促進(jìn)新生血管形成的機(jī)制主要有兩個方面:(1)通過自身分化增殖成為成熟內(nèi)皮細(xì)胞而形成新生血管，無需依賴原來的血管系統(tǒng);(2)EPCs本身可以分泌VEGF或堿性成纖維細(xì)胞生長因子等，通過旁分泌效應(yīng)促進(jìn)局部血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移增殖，形成管腔樣結(jié)構(gòu)，即增強(qiáng)缺血區(qū)域血管生成效應(yīng)，從而改善局部供血[19]。Meier等[20]提出使用粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)的患者EPCs及周圍單核細(xì)胞數(shù)量明顯增加，誘導(dǎo)側(cè)支循環(huán)形成。目前已有臨床實驗證實:在人體內(nèi)，EPCs參與出生后血管新生。值得注意的是，現(xiàn)在與粥樣斑塊相關(guān)的血管新生實驗，多選擇已存在粥樣硬化的患者進(jìn)行長期觀察，通過觀察疾病結(jié)局與循環(huán)EPCs數(shù)量關(guān)系得出相應(yīng)結(jié)果，而無粥樣硬化疾病及處于疾病早期階段的患者未被研究，當(dāng)然這與缺乏發(fā)現(xiàn)早期粥樣硬化的技術(shù)手段不無關(guān)系，但是EPCs與粥樣硬化的發(fā)生及在早期階段對滋養(yǎng)血管的影響，是預(yù)防疾病的關(guān)鍵，值得我們深入探索。

3 探討EPCs用于動脈粥樣硬化患者的安全性

EPCs在血管機(jī)械性損傷模型(后肢缺血模型)中的血管修復(fù)作用得到了廣泛認(rèn)同，在心血管疾病，如急性心肌梗死患者中，自體移植EPCs可改善心肌缺血，減少心肌壞死范圍并增強(qiáng)左室收縮功能[21]。但在動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的作用尚不明確。首先，體內(nèi)EPCs數(shù)量與粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性關(guān)系存在爭議。Tousoulis等[22]表明，在小鼠粥樣硬化模型中，無論是直接使用EPCs，還是間接動員造血祖細(xì)胞，都可減慢斑塊的進(jìn)展和炎癥因子水平。Moon等[23]提出在2型糖尿病患者中EPCs減少，促進(jìn)頸動脈粥樣斑塊形成。Silvestre等[24]則提出不同觀點(diǎn)，在小鼠模型中，使用EPCs治療后，斑塊體積增加，但是其內(nèi)含巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等比例相當(dāng)，得出短期使用EPCs治療不影響斑塊穩(wěn)定性的結(jié)論，雖然長期使用對斑塊穩(wěn)定性效果不明。其次，在冠狀動脈狹窄實施介入治療手術(shù)的患者中，EPCs與內(nèi)膜增生導(dǎo)致支架內(nèi)再狹窄關(guān)系不明。Werner等[25]短期觀察結(jié)果顯示，經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)患者中CD34+KDR+EPCs增高可減低患者心血管事件的病死率。George等[26]提出支架內(nèi)再狹窄患者減少EPCs數(shù)量可加速細(xì)胞增殖，EPCs對內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用。與之相矛盾的是，Pelliccia等[27]研究表明，相對于對照組而言，PCI術(shù)后患者中再狹窄患者EPCs含量更高。其于5年后提出長期觀察結(jié)果:發(fā)現(xiàn)行PCI患者中循環(huán)EPCs增高可增加患者心血管事件的病死率[28]?，F(xiàn)今，EPCs在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用尚不明確，實驗結(jié)果存在偏差可能與其他危險因素干擾、獲取患者血液標(biāo)本時間不一致、患者行PCI術(shù)時處在不同的疾病發(fā)展階段等有關(guān)。

綜上所述，EPCs與粥樣斑塊關(guān)系尚不明確。Liu等[29]推論，祖細(xì)胞在疾病進(jìn)程的不同時間點(diǎn)灌注，其結(jié)果是不一樣的，不適當(dāng)?shù)卦黾覧PCs動員或募集會加速動脈粥樣硬化疾病的進(jìn)程。根據(jù)已有數(shù)據(jù)推測:在粥樣斑塊形成早期，EPCs通過促進(jìn)內(nèi)皮增殖、抑制凋亡等，保持血管內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，防止炎性細(xì)胞募集及粥樣斑塊發(fā)生。即早期EPCs數(shù)量增加可預(yù)防斑塊形成。在晚期階段，內(nèi)皮損傷嚴(yán)重，難以完整修復(fù)，炎癥細(xì)胞持續(xù)作用于粥樣斑塊，且EPCs促使血管壁滋養(yǎng)血管新生，新生血管破裂導(dǎo)致斑塊內(nèi)出血，體積增大轉(zhuǎn)變?yōu)椴环€(wěn)定斑塊。即疾病晚期EPCs數(shù)量增加通過促進(jìn)血管新生，加速疾病進(jìn)展。目前EPCs臨床應(yīng)用的安全性有待更多的研究探索。同時患有粥樣硬化基礎(chǔ)疾病的肢端缺血患者，應(yīng)用EPCs治療更應(yīng)考慮引起嚴(yán)重心血管事件并發(fā)癥的可能性。

4 展望

EPCs作為一種多能干細(xì)胞，促進(jìn)受損內(nèi)皮修復(fù)，且其促血管新生作用明顯增強(qiáng)缺血區(qū)域血流供應(yīng)，引起廣大學(xué)者興趣及關(guān)注。已有學(xué)者將EPCs應(yīng)用于臨床疾病治療，如周圍血管疾病造成肢端缺血，急性心肌梗死引起心肌壞死，效果令人矚目。但是關(guān)于EPCs尚有很多領(lǐng)域不為人知，如EPCs的準(zhǔn)確定義，而非簡單根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)記進(jìn)行識別;EPCs促內(nèi)皮修復(fù)及促血管新生的作用機(jī)制;EPCs旁分泌產(chǎn)生生長因子，在靶細(xì)胞作用的具體信號通路;EPCs與粥樣斑塊發(fā)生發(fā)展的關(guān)系等，這些問題仍然困擾著我們。需要更多學(xué)者加入到EPCs研究的隊伍中，了解其與粥樣斑塊穩(wěn)定性關(guān)系，確保將來祖細(xì)胞臨床應(yīng)用的安全性。

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