組織激肽釋放酶與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑在血管重構(gòu)中的研究進(jìn)展

潘瑋 朱鵬立 綜述 余惠珍 審校

(福建省立醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究室 福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院福建省臨床老年病研究所，福建福州 350001)

血管重構(gòu)(vascular remodeling，VR)是血管為適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境變化而發(fā)生的結(jié)構(gòu)和功能改變，結(jié)構(gòu)變化包括血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)過度增殖，并向內(nèi)膜遷移，細(xì)胞外基質(zhì)(extra－cellular matrix，ECM)如膠原、蛋白聚糖等大分子物質(zhì)合成、降解及重新排列，通過與細(xì)胞表面受體相互作用以及滯留多種生物活性分子等方式參與細(xì)胞行為的調(diào)節(jié)(包括基因的表達(dá)，VSMCs增殖、遷移、分化和凋亡等過程);功能變化表現(xiàn)為血管順應(yīng)性降低及對(duì)血管活性物質(zhì)的反應(yīng)性發(fā)生改變等，是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、血管再狹窄、子癇前期等血管重塑性疾病的病理基礎(chǔ)，取決于局部生長因子、血管活性物質(zhì)以及血流動(dòng)力學(xué)之間動(dòng)態(tài)的相互作用[1]。組織激肽釋放酶和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑可以通過不同機(jī)制抑制病理生理變化的過程改善血管重構(gòu)。

1 激肽釋放酶－激肽系統(tǒng)與血管重構(gòu)

1.1 激肽釋放酶－激肽系統(tǒng)的概述

激肽釋放酶－激肽系統(tǒng)(kallikrein－kinin system，KKS)廣泛存在于許多組織和器官中，由前激肽釋放酶(prekallikrein)、激肽釋放酶(kallikrein，KLK)、激肽原(kininogen)、激肽(kinin)和激肽受體(kinin receptor)和激肽酶(kininaseⅠ、Ⅱ)組成。研究發(fā)現(xiàn)在血漿、腎臟、血管等均存在 KKS，見下圖 1[2]。

圖1 激肽釋放酶系統(tǒng)

激肽原是一種單鏈糖蛋白，哺乳動(dòng)物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)3種激肽原:(1)T－激肽原僅存在于大鼠體內(nèi);(2)高分子量激肽原(HMWK);(3)低分子量激肽原(LMWK)。KLK是一組絲氨酸蛋白酶，分為血漿型激肽釋放酶(plasma kallikrein，PK)和組織型激肽釋放酶(tissue kallikrein，TK)。PK主要存在于血漿中，又稱Fletcher因子，單基因編碼，該基因位于4q35染色體上，由15個(gè)外顯子、14個(gè)內(nèi)含子組成;TK存在于胰腺、腎臟、血管、肺、腎上腺、前列腺等組織，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)TK基因家族至少擁有15個(gè)成員，排列于同一個(gè)染色體位點(diǎn)19q13.4上，其差異大多在于內(nèi)含子的長度不同，依次命名為KLKI～KLK15。在組織損傷和機(jī)體應(yīng)激等情況下，HMWK由PK作用轉(zhuǎn)換為緩激肽(bradykinin，BK，Arg－Pro－Gly－Phe－Ser－Pro－Phe－Arg) 和活性高分子量激肽原(HKα)，LMWK則由TK作用轉(zhuǎn)化為賴氨酰緩激肽(kallidin，Pro－Pro－Gly－Phe－Set－ProPhe－Arg) 和精氨酸緩激肽，賴氨酰緩激肽在氨基肽酶的催化下切去賴氨酸而成為緩激肽。目前比較清楚的激肽受體有B1和B2，它們都是G蛋白偶聯(lián)受體。一般認(rèn)為，BK與B2受體結(jié)合，刺激第二信使如一氧化氮(NO)/環(huán)磷酸腺苷(cGMP)和前列環(huán)素(PGI2)/環(huán)磷酸鳥苷(cAMP)的釋放，從而擴(kuò)張小動(dòng)脈，增加局部血流，抑制腎素分泌，增加血管通透性，調(diào)節(jié)血壓和心血管功能。B1受體僅在細(xì)菌脂多糖(內(nèi)毒素)、白介素刺激、創(chuàng)傷、感染、炎癥等多種致病因素作用下通過激活下游磷脂酶C(pbospholipase C，PLC)、蛋白激酶C、磷脂酶A及內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)等多種途徑，刺激平滑肌細(xì)胞增殖，膠原形成，從而在血管通透性變化、炎癥反應(yīng)、疼痛及參與新生血管的形成過程中發(fā)揮作用[3]。BK及其類似物在激肽酶的作用下降解失活。激肽酶主要有兩類，即激肽酶Ⅰ和Ⅱ，其中激肽酶Ⅱ即是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶。

1.2 激肽釋放酶－激肽系統(tǒng)在血管重構(gòu)中的作用及其分子機(jī)制的研究

VSMCs作為血管壁中的主要細(xì)胞成分，其表型轉(zhuǎn)化及伴隨出現(xiàn)的生物學(xué)行為改變是血管重塑的重要病理學(xué)基礎(chǔ)。VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，即由收縮型轉(zhuǎn)換為合成型，從而含有大量核糖體、高爾基體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，具有合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)和血管活性物質(zhì)的功能[4];在血小板活化脫顆粒釋放的各種細(xì)胞因子[如血小板源性生長因子(platelet－derived growth factor，PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子、表皮生長因子]以及自身分泌和巨噬細(xì)胞分泌的各種細(xì)胞因子的作用下，不斷地增殖并向內(nèi)膜遷移[5]，從而促進(jìn)血管重構(gòu)。

Murakami等[6]研究用腺病毒介導(dǎo)的人KLK1基因轉(zhuǎn)移抑制原代培養(yǎng)SD大鼠的VSMCs增殖，改善球囊損傷后SD大鼠的頸動(dòng)脈新生血管內(nèi)膜形成，提示KLK可能可以抑制VSMCs增殖與遷移抗血管重構(gòu)。已知PDGF是最強(qiáng)的VSMCs體外化學(xué)趨化劑和絲裂原。余惠珍[7]研究顯示人 KLK1基因轉(zhuǎn)移可抑制PDGF－BB誘導(dǎo)的VSMCs增殖與遷移;由于KLK活化激肽原后產(chǎn)生的活性產(chǎn)物賴氨酸－緩激肽(Lys－BK)同樣可顯著抑制PDGF－BB誘導(dǎo)的大鼠VSMCs增殖與遷移，而在B2R基因敲除模型小鼠里，KLK的保護(hù)作用被明顯減弱[8]，故推測(cè)KLK抑制VSMCs增殖與遷移與B2受體有關(guān)，可能通過:(1)BK作用于B2受體，通過G蛋白介導(dǎo)激活磷脂酶C(PLC)，后者可將磷脂酰肌醇水解為 1，4，5－三磷酸肌醇(IP3)和二酰甘油(DAG)，使細(xì)胞內(nèi) Ca+釋放，激活 NOS，釋放 NO[9]。Sun等[10]的研究顯示，NO對(duì)VSMCs遷移的抑制作用呈劑量依賴性;(2)BK作用于B2受體，抑制絲裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路。Redondo等[11]研究顯示，VSMCs的增殖過程需要p38 MAPK參與。近期的研究[12]發(fā)現(xiàn)腺病毒介導(dǎo)的h-KLK基因轉(zhuǎn)移至球囊損傷血管段，血管內(nèi)可表達(dá)KLK，局部BK水平也增高，通過B2受體介導(dǎo)，再激活受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制MAPK磷酸化，上調(diào)細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制蛋白p27Kipl和p21Cipl表達(dá)，使細(xì)胞阻滯于G0/G1期，從而抑制VSMCs增殖。此外，Morissette等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在 PDGF－BB 誘導(dǎo)的遷移實(shí)驗(yàn)中，B1受體阻滯劑明顯逆轉(zhuǎn)賴氨酸－緩激肽抑制遷移效應(yīng)，而B2受體阻滯劑Hoel40則不影響這種抑制效應(yīng)，提示BK通過B1受體抑制平滑肌細(xì)胞遷移的作用。

目前臨床上最常用的KLK是來源于豬的胰激肽釋放酶，由于動(dòng)物來源的胰激肽釋放酶對(duì)人類是一種異種蛋白，靜脈給藥具有很強(qiáng)的免疫原性;而口服給藥因蛋白酶解作用會(huì)極大降低藥物的利用率，所以基因治療引起人們的關(guān)注，但利用h-KLK進(jìn)行血管重塑性疾病的基因治療存在如下問題:(1)重復(fù)性問題，沒有證據(jù)證明重復(fù)多次給予KLK基因以后KLK基因降壓效應(yīng)不會(huì)降低;(2)安全性問題，沒有證據(jù)證明長期、多次及重復(fù)給予KLK基因后不會(huì)有相應(yīng)抗體產(chǎn)生，病毒載體安全性仍無保證;(3)時(shí)效問題，近來有研究考慮應(yīng)用人KLK基因大量生產(chǎn)蛋白質(zhì)產(chǎn)物人源性組織激肽釋放酶來抗血管重構(gòu)，但仍需進(jìn)一步研究可行性。

2 基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制物系統(tǒng)與血管重構(gòu)

2.1 基質(zhì)金屬蛋白酶的概述

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一類降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜成分的鋅離子(Zn2+)依賴性內(nèi)肽酶家族，根據(jù)降解的底物不同及序列的相似性，分成6類:(1)膠原酶類(collagenases)(MMP－1，8，13，18)，降解間質(zhì)膠原;(2)明膠酶類(gelatinases)，包括 MMP－2 及 MMP－9，降解變性的膠原及基膜的IV型膠原;(3)基質(zhì)分解素(stromelysins)，MMP－3 與 MMP－10;(4)基質(zhì)溶解因子(matrilysins)，MMP－7 及 MMP－26;(5)膜型基質(zhì)金屬蛋白酶(membrane－type，MT－MMPs)，此組中共有 6 個(gè)成員，4 個(gè)是 I型跨膜蛋白(MMP－14，15，16，24)，兩個(gè)是 GPI錨連蛋白(MMP－17 及 MMP－25);(6)其他種類的 MMPs。

2.2 基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的概述

基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(matrix metalloproteinases inhibitors，MMPIs)分為體內(nèi)天然的抑制劑以及人工合成的抑制劑。組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitors of MMPs，TIMPs)和 α－2 巨球蛋白是 MMPs的天然抑制物[14]，TIMPs抑制 MMPs的激活機(jī)制:(1)在酶原活化階段，TIMPs與基質(zhì)金屬蛋白酶前體(pro－MMP)可形成穩(wěn)定的復(fù)合體，阻礙pro－MMP的酶原自我激活;(2)在活化的MMP階段，TIMP可直接與活化的MMP形成緊密的1∶1復(fù)合體，抑制其活性。目前已證實(shí)的 TIMPs有4 種(TIMP－1，2，3 和4)，TIMP－1 相對(duì)分子質(zhì)量為 28 500，它可與活化的 MMP－1，3，9 和除MT－MMP外大多數(shù)MMPs形成1∶1的復(fù)合物，降低細(xì)胞外基質(zhì)的降解;TIMP－2相對(duì)分子質(zhì)量為21 000，主要抑制MMP－2活性，同時(shí)能阻斷所有被激活的MMPs的水解酶活性。TIMP－3是一種結(jié)合于細(xì)胞外基質(zhì)的非可溶性蛋白，Huang等[15]研究表明 TIMP－3 是 MMP－9的特異性抑制物，除MMPs外還可以抑制去整合素和金屬蛋白酶(A disintegrin and metalloprotease，ADAM)的功能。由于有更廣泛的抑制譜，TIMP－3基因敲除的小鼠可以引起肺氣腫樣的肺泡損傷[16]，并加速斷奶后乳腺上皮細(xì)胞的凋亡。TIMP－4抑制新生血管的形成，抑制VSMCs遷移。

人工合成的MMPIs在結(jié)構(gòu)上都具有2個(gè)共同特點(diǎn):(1)含有一個(gè) Zn2+結(jié)合基團(tuán)(zinc－binding－groups，ZBG)，可與MMP活性中心的 Zn2+配位結(jié)合進(jìn)而使MMPs失活;(2)分子骨架富含能形成氫鍵的原子或基團(tuán)，以增加整個(gè)分子與酶的親和力，決定MMPIs的選擇性以及藥代動(dòng)力學(xué)特性?；赯n2+結(jié)合基(ZBGs)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，分為5類:(1)異羥肟酸類;(2)反式異羥肟酸類;(3)非異羥肟酸類;(4)各種天然產(chǎn)物MMPIs;(5)非Zn2+結(jié)合基MMPIs。

2.3 基質(zhì)金屬蛋白酶與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑在血管重構(gòu)中的作用及其分子機(jī)制的研究

細(xì)胞外基質(zhì)是存在于組織細(xì)胞表面或細(xì)胞之間的一組蛋白大分子，主要包括膠原蛋白、非膠原糖蛋白和蛋白多糖。血管重構(gòu)實(shí)質(zhì)由細(xì)胞外基質(zhì)的降解和合成失衡引起，當(dāng)血管損傷時(shí)，血管壁細(xì)胞受多種細(xì)胞因子和生長因子的刺激，分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)。在大量細(xì)胞外基質(zhì)合成的同時(shí)，VSMCs和內(nèi)皮細(xì)胞合成MMPs增加，導(dǎo)致原有基質(zhì)發(fā)生特異性降解，細(xì)胞外纖維連接蛋白沉淀，被激活細(xì)胞侵入病變區(qū)，Ⅰ和Ⅳ型膠原沉積增加，最后形成典型膠原纖維交互聯(lián)結(jié);血管在這種細(xì)胞外基質(zhì)降解和新的基質(zhì)成分沉積增加的過程中發(fā)生重構(gòu)。MMPs、TIMPs影響細(xì)胞外基質(zhì)的降解與重合成對(duì)維持血管正常的形態(tài)及功能非常重要。(1)在血管重塑性疾病中，MMPs在損傷血管中高表達(dá)，高表達(dá)的MMPs反過來進(jìn)一步通過降解細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)炎癥細(xì)胞的遷移、黏附[17]，參與血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移與凋亡。(2)MMPs通過促進(jìn)多潛能干/祖細(xì)胞的遷移參與血管重構(gòu)。Laxton 等[18]發(fā)現(xiàn) MMP－8 可以促進(jìn)多能干/祖細(xì)胞從動(dòng)脈管腔或動(dòng)脈外膜遷移，參與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，ApoE和MMP－8雙基因敲除的小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成減少。(3)血管內(nèi)皮細(xì)胞被活化表達(dá)MMPs，活化的MMPs降解血管基膜和細(xì)胞外基質(zhì)，使血管內(nèi)皮細(xì)胞分離，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移及凋亡，引起血管重構(gòu)。有研究證明活化的MMP－1促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptors，VEGFR)的表達(dá)，通過與血管內(nèi)皮生長因子作用，介導(dǎo)蛋白酶活化受體－1和核轉(zhuǎn)錄因子(NF－κB)信號(hào)通路促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖[19]。(4)MMPs促進(jìn)中膜VSMCs增殖與遷移參與血管重構(gòu)。Kim等[20]發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞在MMP－2的作用下進(jìn)行有絲分裂和遷移，使血管壁增厚，而MMP－2缺乏會(huì)減少頸動(dòng)脈結(jié)扎后的VSMCs的遷移，抑制內(nèi)膜的增生。

體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MMPI基因轉(zhuǎn)染可以抑制VSMCs的遷移和新生內(nèi)膜的形成。Ramirez等[21]通過球囊拉傷的方法建立大鼠頸動(dòng)脈再狹窄模型后，給予攜帶TIMP－1基因的腺病毒進(jìn)行干預(yù)，觀察發(fā)現(xiàn)，攜帶TIMP的腺病毒能夠成功轉(zhuǎn)染VSMCs，并在動(dòng)脈壁中持續(xù)表達(dá)數(shù)周，病理切片發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染TMIP－1的大鼠損傷部位2周后內(nèi)膜中膜厚度比減少70.5%，1個(gè)月后減少58.5%，2個(gè)月后減少52.4%。Dollery和Ramirez等得出相同的結(jié)果。Tong等[22]用腺病毒介導(dǎo)TIMP－4基因轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn)TIMP－4同樣具有抑制VSMCs遷移的作用。同時(shí)TIMP轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮細(xì)胞的遷移率也明顯降低，細(xì)胞外基質(zhì)的合成也明顯受抑制。

目前MMPIs臨床上主要用于治療關(guān)節(jié)炎、腫瘤等疾病。巴馬司他(batimastat)是第一個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)治療癌癥的MMPs抑制劑。

3 基因治療與血管重構(gòu)

3.1 基因治療的概述

基因治療是應(yīng)用基因工程和細(xì)胞生物技術(shù)治療疾病的一種方法。1990年9月14日美國官方首例批準(zhǔn)用基因方法治療由腺苷脫氨酶(adenosine deaninase，ADA)基因缺陷引起的重度聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)，開拓了基因治療的歷史。近來攜帶有低密度脂蛋白(low－density lipoprotein，LDL)受體基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入肝細(xì)胞可以有效清除LDL，降低高脂血癥，已用于臨床[23]。

隨著人類基因組計(jì)劃順利完成和功能基因組計(jì)劃的發(fā)展，多基因疾病的研究已成為當(dāng)前和今后一段相當(dāng)長時(shí)期內(nèi)倍受關(guān)注的焦點(diǎn)。多基因疾病受多個(gè)基因控制，其復(fù)雜的表型性狀雖然表現(xiàn)出一定的家族聚集傾向性，但并不完全符合孟德爾遺傳規(guī)律，受環(huán)境及其他非遺傳因素和潛在的患病風(fēng)險(xiǎn)基因共同作用。近年來發(fā)現(xiàn)，由于轉(zhuǎn)染效率不足，功能基因表達(dá)水平低下等原因單基因轉(zhuǎn)移極大地限制了基因治療的臨床療效，采用多基因治療有望在相同的DNA遞送效率下增加外源基因的有效轉(zhuǎn)錄，提高其表達(dá)水平，并使之產(chǎn)生協(xié)同作用，為多基因疾病治療的臨床方案提供依據(jù)。

國內(nèi)外開展的多基因共表達(dá)已廣泛用于腫瘤疾病的治療，Xu等[24]用 MDA-7/IL-24雙基因共表達(dá)靶向抗結(jié)腸腫瘤。Dong等[25]用MDA-7/IL-24雙基因共表達(dá)靶向治療白血病。除了靶向抗腫瘤外，雙基因共同表達(dá)還可以增強(qiáng)新生血管成骨作用。Mattar等[26]用BMP-2/VEGF-165雙基因共轉(zhuǎn)染大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)血管成骨作用，從而為激素性股骨頭壞死(SANFH)提供新的治療思路。雙基因共表達(dá)還可以治療血管性疾病，范波勝等[27]構(gòu)建神經(jīng)生長因子(NGF)與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)165雙基因共同表達(dá)載體pIRES-NGF-VEGF165以期達(dá)到治療腦梗死的目的。Jazwa等[28]運(yùn)用VEGF-A和FGF-4雙基因共同表達(dá)促進(jìn)急性肢體缺血的恢復(fù)。Rayssac等[29]研究發(fā)現(xiàn)，采用纖維生長因子2和Cyr61雙基因共同表達(dá)載體，可明顯增加小鼠缺血下肢的新生血管密度。

3.2 多基因共同表達(dá)在血管重構(gòu)中的研究進(jìn)展

大多數(shù)血管重塑性疾病為多基因疾病。早期Ohno等[30]以雙球囊導(dǎo)管將攜有單純皰疹病毒－胸苷激酶(HSV-TK)基因的腺病毒載體定位轉(zhuǎn)移至小型豬球囊擴(kuò)張損傷的冠狀動(dòng)脈段，連續(xù)6 d靜脈注射抗病毒藥物丙氧鳥苷，結(jié)果顯示治療VSMCs增殖活動(dòng)明顯減弱，動(dòng)脈內(nèi)膜與中膜比值縮小。Olivier等嚴(yán)格地比較了腺病毒介導(dǎo)的PAI-1、NOS及TK基因轉(zhuǎn)染配合丙氧鳥苷對(duì)損傷后再狹窄形成的防治作用，發(fā)現(xiàn)TK/GCV組的療效最好。在此基礎(chǔ)上，Cao等[31]研究共同表達(dá)CD和TK雙自殺基因?qū)ζ交〖?xì)胞的殺傷作用大于CD或TK單自殺基因。類似的雙基因共同表達(dá)的研究在國內(nèi)也有報(bào)道。Zhang等[32]研究證明VEGF和PDGF雙基因共同表達(dá)在體外可明顯促進(jìn)VSMCs的增殖，促進(jìn)血管重構(gòu)。Nakanishi等[33]構(gòu)建 MAPKAPK3和FHL5雙基因共同表達(dá)載體，抑制血管內(nèi)膜增生，抑制血管重構(gòu)。KLK和TIMP基因分別具有抑制血管平滑肌增殖和遷移的作用，結(jié)合多基因共同表達(dá)載體構(gòu)建技術(shù)的發(fā)展，考慮可以協(xié)同KLK和TIMP構(gòu)建雙基因共同表達(dá)載體抑制VSMCs的增殖與遷移，抗血管重構(gòu)。

4 展望

從1990年美國進(jìn)行基因治療至今已有23年時(shí)間，心血管基因治療領(lǐng)域已有很大的發(fā)展。基因轉(zhuǎn)染與其他遺傳學(xué)技術(shù)結(jié)合已證實(shí)可用于制造各種心血管病的動(dòng)物模型，可以對(duì)心血管系統(tǒng)的各種表選蛋白的功能進(jìn)行深入研究?；蛑委煵粌H能治療成年人的心血管疾病，還可應(yīng)用基因工程方法生產(chǎn)出各種基因藥物治療心血管疾病。心血管系統(tǒng)基因治療的領(lǐng)域無限廣闊，KLK和MMPI基因在血管重構(gòu)中的作用以及雙基因共同表達(dá)載體的構(gòu)建技術(shù)將為治療血管重塑性疾病提供新的治療前景，但仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究探討其可行性。

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