尿液中膀胱癌腫瘤標(biāo)記物的研究進(jìn)展

曲知專 卓育敏

目前膀胱癌診斷及隨訪主要依靠尿細(xì)胞學(xué)檢查與尿道膀胱鏡檢相結(jié)合的手段，然而侵入性的尿道膀胱鏡檢操作不便，給患者帶來較大的痛苦，還有感染、出血等風(fēng)險。因此，尋找可用于膀胱癌早期診斷及判斷預(yù)后的無創(chuàng)指標(biāo)非常重要，尿液是膀胱癌理想的腫瘤標(biāo)記物來源。理想的膀胱腫瘤標(biāo)記物應(yīng)該具有的實驗室特征：尿、血和腫瘤組織中存在并且其含量逐漸減少；不但精確預(yù)示腫瘤的存在，而且能夠預(yù)示腫瘤的侵襲狀態(tài)；標(biāo)記物的水平須同疾病的嚴(yán)重程度相一致；檢測方法具有高度的敏感性和特異性。臨床潛在作用：篩選高危人群；對血尿和排尿刺激癥狀患者的檢查評價；患者術(shù)后的監(jiān)測。臨床使用特點：檢測結(jié)果的可重復(fù)性；收集標(biāo)本方法簡單實用；獲取結(jié)果迅速，成本不高；檢測方法簡單，最好能在門診進(jìn)行。本文將近年來尿液中膀胱癌腫瘤標(biāo)記物的研究進(jìn)行了綜述。

1 目前通過美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)用于臨床的膀胱癌相關(guān)的無創(chuàng)診斷方法

1.1 尿細(xì)胞學(xué)（cytology） 尿細(xì)胞學(xué)不屬于腫瘤標(biāo)記物范疇，作為膀胱腫瘤診斷金標(biāo)準(zhǔn)已多年，傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)（conventional cytology，CC）的涂片質(zhì)量不十分理想，從而影響到細(xì)胞學(xué)的診斷。尿脫落細(xì)胞學(xué)檢測膀胱癌的敏感性為13%～75%，特異性為85%～100%，敏感性與腫瘤細(xì)胞分級密切相關(guān)。1996年FDA批準(zhǔn)的液基細(xì)胞學(xué)檢測（1iquid based cytology，LBC）技術(shù)，從根本上改變了傳統(tǒng)涂片的制作方法，檢測膀胱癌的敏感性為達(dá)90%以上，特異度方面與傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)相當(dāng)，對膀胱癌的診斷比傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)更準(zhǔn)確[1]。目前常見的幾種液基細(xì)胞學(xué)檢查技術(shù)有：新柏氏TCT技術(shù)、超柏氏LCT技術(shù)、利普液基細(xì)胞學(xué)LPT技術(shù)、國產(chǎn)液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)如LBP。尿細(xì)胞學(xué)對診斷高分級的膀胱腫瘤具有較高的敏感度，但對低分級的則敏感度較差，且其結(jié)果易受操作者影響等缺點，尋找理想的尿液中腫瘤標(biāo)記物彌補其缺點，甚至與其一同成為診斷金標(biāo)準(zhǔn)顯得意義重大。

1.2 膀胱腫瘤抗原（bladder tumor antigen，BTA） 膀胱腫瘤抗原（bladder tumor antigen，BTA）又稱人補體因子H相關(guān)蛋 白（human complement factor H related protein，HCFHrp）。腫瘤細(xì)胞分泌內(nèi)源性基底蛋白與基底膜表面蛋白受體相結(jié)合，并釋放蛋白水解酶破壞基底膜，基底膜碎片進(jìn)入膀胱內(nèi)聚成高分子復(fù)合物即BTA。BTA檢測方法包括BTA、便攜式免疫分析（BTA stat）和實驗室ELISA（BTA TRAK）。其中早期的BTA方法是檢測基底膜降解復(fù)合物，BTA stat和BTA TRAK是BTA的改進(jìn)方法，可通過單克隆抗體的方法檢測尿液中人類H相關(guān)蛋白補充因子，可在門診快速得到定性和定量結(jié)果。BTA的有優(yōu)點是其高敏感度，缺點是其高的假陽性率，尤其是當(dāng)患者存在非癌性血尿或感染[2]。在2008年一項前瞻性多中心臨床試驗501位患者中，BTA統(tǒng)計監(jiān)測報告的膀胱癌復(fù)發(fā)的敏感性（56%）大于細(xì)胞學(xué)檢查（19.2%）的，特別是在1級病變（48%：13%），特異性仍不及細(xì)胞學(xué)（85.7%：98.3%）[3]。

1.3 核基質(zhì)蛋白22（nuclear matrix protein 22，NMP22） 細(xì)胞核的成分之一，參與姊妹染色體的正確分離；腫瘤細(xì)胞在凋亡中釋放出來。膀胱癌患者尿中NMP22水平是正常人的25倍?？梢杂枚嗫寺】贵w（NMP22 test）或免疫定量分析（NMP22 bladder check）檢測尿液中NMP22水平監(jiān)測膀胱癌復(fù)發(fā)，其在檢測原發(fā)膀胱癌方面較差，Vinod Kumar Arora等[4]研究表明NMP22和細(xì)胞學(xué)檢測膀胱腫瘤的敏感性分別為79%和65.8%，特異性分別為80%和100%。其在低級別的腫瘤中敏感性優(yōu)于細(xì)胞學(xué)檢查的。FDA已承認(rèn)其在監(jiān)測膀胱癌復(fù)發(fā)方面的作用。Hosseini等[5]研究表明NMP22檢測和細(xì)胞學(xué)檢測復(fù)發(fā)的敏感性分別為78.8%和44.2%，特異性分別為69.6%和83.7%?，F(xiàn)很少單獨應(yīng)用，多與細(xì)胞學(xué)聯(lián)合應(yīng)用以提高癌檢出率。

1.4 ImmunoCyt ImmunoCyt是一種結(jié)合了尿細(xì)胞學(xué)和熒光免疫細(xì)胞化學(xué)的獨創(chuàng)技術(shù)，屬于免疫細(xì)胞學(xué)檢查，利用單抗19A211及抗體M344、LDQIO，通過免疫熒光顯微鏡去識別尿細(xì)胞表面的膀胱癌粘蛋白抗原（M344、LDQ10）和糖基化癌胚抗原的高分子量成分（19A211），其更普遍存在于低級別的表淺性膀胱癌中，具有較好的敏感性，較尿細(xì)胞學(xué)檢查有明顯優(yōu)勢。最近1個單中心研究ImmunoCyt顯示其檢測膀胱腫瘤的敏感性為73%，特異性為49%[6]。有研究顯示ImmunoCyt在低級別腫瘤檢測方面比無論是尿細(xì)胞學(xué)或FISH都更為敏感。特異性無明顯差異[7]。但由于其高成本，對器械的要求及對檢驗醫(yī)生水平要求較高也限制了其推廣，目前它僅用于尿細(xì)胞學(xué)檢測之外的輔助檢測。

1.5 熒光原位雜交（FISH） FISH用于尿路上皮癌的診斷和術(shù)后監(jiān)測，其靈敏度及特異度是現(xiàn)今尿液腫瘤標(biāo)志物檢查方法中最高的一種。且其檢測結(jié)果不受卡介苗（BCG）治療的影響，可用于BCG膀胱灌注治療的監(jiān)測。但由于FISH法的工作量大且費用高，因此在臨床應(yīng)用受到限制。2008年Hajdinjak[8]對14項研究共2477次的FISH檢測結(jié)果進(jìn)行Meta分析得出結(jié)論：fish診斷尿路上皮癌總的敏感性為72%，特異性83%，而尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查的敏感性及特異性分別為42%及96%尤其對于低分級低分期腫瘤，fish檢測膀胱癌的敏感度要遠(yuǎn)高于尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查，將Ta期腫瘤去除后再進(jìn)行分析，fish診斷膀胱癌的敏感度仍然高于尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查，分別為86%及61%。國內(nèi)雖有研究顯示我國膀胱癌患者的染色體號和畸變發(fā)生率與國外報道間存在顯著差異[9]。但近年來的國內(nèi)相關(guān)研究也都表明FISH的敏感度和特異性在國人膀胱癌的診斷上亦是理想的一種。隨訪過程中當(dāng)FISH檢查再次出現(xiàn)陽性時，則可認(rèn)定是膀胱癌復(fù)發(fā)。FISH還可以作為尿細(xì)胞學(xué)或ImmunoCyt的一個確證試驗[7]。FISH檢查有望和細(xì)胞學(xué)一同成為診斷膀胱腫瘤金標(biāo)準(zhǔn)。

2 處于研究階段的膀胱癌腫瘤標(biāo)志物

2.1 膀胱特異性核基質(zhì)蛋白（BLCA） 1996年，Getzenberg等[10]對17例膀胱癌組織和正常組織研究首次分離確定了9種膀胱核基質(zhì)蛋白，其中6種只在膀胱癌組織中表達(dá)而在正常膀胱人膀胱組織中缺乏，這6種核基質(zhì)蛋白命名BLCA1、2、3、4、5、6；另外3種只存在于正常人的膀胱組織中，命名為BLNL-1、2、3。對膀胱癌細(xì)胞系253j、T24和UMUC-2研究中發(fā)現(xiàn)6種BLCA的5種（BLCA-1、2、3、4、6）存在于3種癌細(xì)胞系中，BLNL1-BLNL3未發(fā)現(xiàn)存在于癌細(xì)胞系中，此組蛋白在膀胱癌轉(zhuǎn)化與形成中的相互聯(lián)系和作用尚不清楚，檢測BLCA-4的抗體多為抗人BLCA-4多克隆抗體，更加特異的單克隆抗體正在研究將使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確；同時還需進(jìn)行大量病例的研究，建立更高的正常臨界值，以提高其特異性，而不降低敏感性。國內(nèi)有人制備了BLCA-4單克隆抗體并檢測15例膀胱癌標(biāo)本，其敏感度和特異度分別為93.3%和100%[11]，最近一項研究表明BLCA-4高表達(dá)的膀胱癌患者預(yù)后差[12]。BLCA族其他成員在檢測膀胱癌中的價值也尚處于基礎(chǔ)階段。

2.2 透明質(zhì)酸及透明質(zhì)酸酶 HA為一種葡萄糖氨基聚糖，是真核細(xì)胞胞外基質(zhì)和體液的基本成分。在腫瘤組織，升高的HA大部分集中在腫瘤基質(zhì)中。HAase是一種降解HA的內(nèi)生性糖苷酶，能促進(jìn)腫瘤侵襲。目前發(fā)現(xiàn)有三種HAase基因，誘導(dǎo)膀胱癌的類型是HYALI型；多元統(tǒng)計分析則表明[13]，HYALI檢測腫瘤的肌層浸潤準(zhǔn)確率為76.8%，腫瘤復(fù)發(fā)準(zhǔn)確率為67.8%，在預(yù)測腫瘤肌層侵犯和轉(zhuǎn)移方面，是一個很有潛力的能獨立預(yù)測預(yù)后的標(biāo)記物。

2.3 細(xì)胞角蛋白（eytokeratins，CK） 細(xì)胞角蛋白（eytokeratins，CK）是上皮細(xì)胞中間絲的組成成分，表達(dá)水平依賴于上皮類型、分化及惡性程度，也是一種常用的腫瘤免疫組織化學(xué)標(biāo)記物，陽性表達(dá)見于上皮細(xì)胞、間皮細(xì)胞；癌，間皮瘤等。上皮組織存在20種不同的CK，幾乎所有上皮細(xì)胞在惡性轉(zhuǎn)化過程中均維持其表達(dá)量，因而是上皮來源腫瘤細(xì)胞的一種特征性變化。與膀胱癌相關(guān)的有CK8、CKl8、CKl9和CK20。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗（UBC Ⅱ ELISA）測量尿液中的細(xì)胞角蛋白8和18對膀胱原位癌的診斷有一定意義，尤其是對膀胱原位癌，但其對膀胱腫瘤總的敏感性及特異性低[14]。CYFRA21-l是CKl9的可溶性片段，通過識別2株單克隆抗體BMl9-21和KSl9-l的雙抗體夾心法進(jìn)行測定，對Gl期膀胱癌的敏感性較好。CK20并不是一個真的可溶性標(biāo)記物，它需要對脫落細(xì)胞采用RT-PCR進(jìn)行處理，檢測復(fù)雜、昂貴，在許多非惡性疾病甚至健康人群中也會增高，總之現(xiàn)今CK的檢測方法均不如尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查，限制其發(fā)展和應(yīng)用。

2.4 微衛(wèi)星（Microsatelite MS） 微衛(wèi)星是廣泛存在于原核及真核細(xì)胞基因組中高多形性短陣串聯(lián)的DNA重復(fù)序列（每對大概24個堿基）。目前在許多腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了微衛(wèi)星異常，包括雜合性缺失和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（體細(xì)胞微衛(wèi)星位點的擴(kuò)增、丟失和缺失），有學(xué)者發(fā)現(xiàn)國內(nèi)膀胱癌患者微衛(wèi)星異常較集中于 D18S46、IFNA、D85S137、D16S47 6等位點[15]，檢出率約為80%，與國外報道顯著不同。由于MS數(shù)目龐大，分布較廣，敏感性和特異性受選擇的位點及其組合的影響，而位點及其組合的篩選需考慮種族、地域的影響，因此如何選擇恰當(dāng)?shù)奈稽c，值得深入研究。

2.5 纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)n） FN是一種大分子非膠原糖蛋白，在泌尿系統(tǒng)它只存在于尿路上皮的基底膜及黏膜下層。膀胱癌中基底膜FN均有不同程度的喪失，腫瘤侵犯基底膜以及誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白酶增加了FN從基底膜中的釋放，而使尿中FN的含量上升。國內(nèi)有學(xué)者首先報道用尿FN診斷膀胱癌[16]，近年來也已自主研究出一種FN試紙，可作為人群的篩檢和門診的初診手段，現(xiàn)已致力于FN試紙的臨床研究，正努力獲得國內(nèi)的認(rèn)可和批準(zhǔn)。

2.6 存活素（survivin） 與抑制細(xì)胞凋亡細(xì)胞周期調(diào)控腫瘤血管形成腫瘤細(xì)胞耐藥等有關(guān)，是一個具有潛在價值的腫瘤標(biāo)志物，與腫瘤的預(yù)后也密切相關(guān)。Survivin基因在胎兒的發(fā)育過程中有表達(dá)，成人健康組織中檢測不到，但許多腫瘤中豐富表達(dá)。Survivin能在膀胱癌尿液中檢測到，并與其復(fù)發(fā)、分期、預(yù)后和死亡率相關(guān)。利用RT-PCR技術(shù)檢測尿液中Survivin的mRNA，可用于篩選血尿患者，但診斷的穩(wěn)定性需大量的樣本來驗證。

2.7 成纖維細(xì)胞生長因子受體3（FGFR3） 很多生長因子在文獻(xiàn)暈都有報道，如表皮生長因子受體、血管上皮生長因子、腫瘤壞死因子、纖維母細(xì)胞生長因子受體3（FGFR3）等。van Oers等[16]在一項280人的病例研究中發(fā)現(xiàn)FGFR3的變異率在膀胱癌和上尿道腫瘤的發(fā)生率相當(dāng)，并且與低度惡性腫瘤相關(guān)。約50%的早期膀胱腫瘤中存在FGFR3突變，存在該突變的腫瘤患者多預(yù)后較好。

2.8 DNA甲基化 DNA甲基化腫瘤相關(guān)基因啟動子CpG島甲基化狀態(tài)異常廣泛見于腫瘤，有望作為臨床腫瘤診斷的分子標(biāo)記。并與腫瘤浸潤發(fā)展、患者預(yù)后及總的生存率相關(guān)[17]。

2.9 其他 p53基因、癌胚抗原（carcinoma embryonic antigen，CEA）、端粒酶（Telomerase）、尿脫落細(xì)胞Lewis X抗原檢測、纖維蛋白原降解產(chǎn)物（FDP）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）、尿激酶纖溶酶原激活物（Urinary urokinase-type plasminogen activator，uPA）、粘蛋白7（Mucin 7）、微小染色體維持蛋白5（minichromosome maintenance proteins 5，MCM5）、Upk3a、細(xì)胞分裂周期蛋白基因6（cell division cycle 6，CDC6）等均有待進(jìn)一步研究及驗證。

3 結(jié)論、存在問題及展望

許多腫瘤標(biāo)志物檢測方法的敏感度尤其在低級別腫瘤檢測方面高于尿細(xì)胞學(xué)檢測的，可彌補其不足，但多有特異性低、需要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化前瞻性的多中心研究以驗證其可行性、缺乏標(biāo)準(zhǔn)化和可重復(fù)性差等不足。BTA、FISH檢查在檢測低級別腫瘤較尿脫落細(xì)胞學(xué)更有優(yōu)勢。NMP22適用于膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)的監(jiān)測，單獨使用易誤診。FISH有望和尿細(xì)胞學(xué)一同成為膀胱癌診斷金標(biāo)準(zhǔn)，尤其在原位癌及pTa期膀胱癌?，F(xiàn)仍沒有發(fā)現(xiàn)可用于檢測癌前病變的標(biāo)記物，期望不久的將來，各種標(biāo)志物試紙的出現(xiàn)會使膀胱癌的檢測更為無創(chuàng)、方便、快捷。

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