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    野百合堿預(yù)處理對(duì)大鼠右心室功能及規(guī)范性瞬時(shí)感受器電位亞家族表達(dá)的影響

    2014-03-04 02:18:34蔡克鋒陳慧勤徐訓(xùn)發(fā)林偉強(qiáng)許朝祥陳國(guó)楨
    中國(guó)循環(huán)雜志 2014年11期

    蔡克鋒,陳慧勤,徐訓(xùn)發(fā),林偉強(qiáng),許朝祥,陳國(guó)楨

    野百合堿預(yù)處理對(duì)大鼠右心室功能及規(guī)范性瞬時(shí)感受器電位亞家族表達(dá)的影響

    蔡克鋒,陳慧勤,徐訓(xùn)發(fā),林偉強(qiáng),許朝祥,陳國(guó)楨

    目的:探討腹腔注射野百合堿(MCT )3周對(duì)大鼠右心室功能的影響以及規(guī)范性瞬時(shí)感受器電位(TRPC) 亞家族在野百合堿誘導(dǎo)的右心室心肌肥厚中的表達(dá)。

    野百合堿;規(guī)范性瞬時(shí)感受器電位;心肌肥厚;Ca2+

    (Chinese Circulation Journal, 2014,29:928.)

    慢性肺源性心臟病是由肺組織、肺血管或胸廓的慢性病變引起肺組織結(jié)構(gòu)和功能異常,肺血管阻力增加,肺動(dòng)脈壓力增高,使右心室擴(kuò)張、肥厚伴或不伴右心功能衰竭的心臟病。慢性肺源性心臟病80%~90%由慢性阻塞性肺疾?。–OPD)引起,是嚴(yán)重危害人體健康的常見(jiàn)病,受到醫(yī)學(xué)界的廣泛重視。慢性肺源性心臟病發(fā)病過(guò)程中,早期的心肌肥厚可能是心肌細(xì)胞對(duì)外界的刺激的一種適應(yīng)性改變,有一定的代償意義,有利于維持心輸出量,但長(zhǎng)期的心肌肥厚最終會(huì)導(dǎo)致心力衰竭甚至猝死。因此,研究心肌肥厚的發(fā)病機(jī)制,尋找可行的治療靶點(diǎn)對(duì)治療慢性肺源性心臟病具有重要的意義。以往的研究發(fā)現(xiàn)Ca2+信號(hào)在誘導(dǎo)心肌肥厚發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到重要作用[1],肥厚心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)Ca2+處于持續(xù)性高水平[2],且降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度,能顯著抑制心肌細(xì)胞肥大。目前的研究表明規(guī)范性瞬時(shí)感受器電位(TRPC)亞家族成員與Ca2+內(nèi)流有關(guān),它能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度,參與細(xì)胞的肥大和凋亡[3]。TRPC亞家族有7種亞型,分別為TRPC1~7。TRPC通道可能參與了受體操縱的離子通道、鈣池操縱的離子通道和牽張激活性離子通道。由于以往關(guān)于TRPC亞家族的報(bào)道一般是通過(guò)腹主動(dòng)脈縮窄法誘導(dǎo)左心室心肌肥厚大鼠模型來(lái)進(jìn)行研究的[4],而野百合堿(MCT)誘導(dǎo)的右心室心肌肥厚的模型報(bào)道較少,本研究旨在明確MCT誘導(dǎo)的右心室肥厚大鼠模型的心肌細(xì)胞上哪些TRPC亞型介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流參與了心肌肥厚的發(fā)病,從而為臨床治療慢性肺源性心臟病提供新的靶點(diǎn)和思路。

    1 材料和方法

    材料:本實(shí)驗(yàn)的起止時(shí)間為2012-08至2014-02。試劑包括:逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara,日本)、總核糖核酸抽提試劑Trizol(Invitrogen,美國(guó))、ROX染料(RoMCTe,瑞士),引物(生工生物工程有限公司,上海),RIPA裂解液(碧云天,江蘇)、PMSF蛋白酶抑制劑(碧云天,江蘇)、化學(xué)發(fā)光試劑Novex ECL(Invitrogen, 美國(guó)),大鼠抗大鼠β-Actin抗體(Abcam,英國(guó)),兔抗大鼠TRPC6抗體(Abcam,英國(guó)),野百合堿(Sigma,美國(guó))。儀器包括:O2濃度分析儀(ProOX-110 型, 美國(guó)BioSpherix公司)、O2濃度探頭(E702型, 美國(guó)Bio Spherix公司)、壓力換能器(YPJ01型, 成都儀器廠)、生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)( RM6240 型, 成都儀器廠)、冷凍高速離心機(jī)(Heraeus公司,德國(guó))、StepOne實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(ABI公司,美國(guó))、BIO-RAD Mini Trans-Blot Cell 小型轉(zhuǎn)印槽(Bio-Rad 公司,美國(guó))、Mini-Protean Tetra 電泳槽(Bio-Rad 公司,美國(guó))。

    野百合堿誘導(dǎo)的大鼠模型的建立:健康SD大鼠,雄性,體質(zhì)量 (200±20)g (上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司),共20只,隨機(jī)分成對(duì)照組和MCT誘導(dǎo)組(MCT組)各10只。根據(jù)李波等[5]的研究,本研究采用MCT給藥3周的方法。對(duì)照組:SD大鼠常壓下飼養(yǎng)3周;MCT組:以2 % MCT 60 mg/kg劑量一次性腹腔注射后,再在常壓下飼養(yǎng)3周。

    右心室收縮壓(RVSP)、右心室內(nèi)壓變化率(±dp/dtmax)的測(cè)定: 兩組大鼠均分別腹腔注射肝素50 IU/100g,5 min再行后氨基甲酸乙酯1g/kg腹腔麻醉后,從右頸外靜脈插管直到右心室,記錄大鼠右心室收縮壓、右心室內(nèi)壓力最大上升/下降速率(RV±dp/dtmax)。

    右心肥大指數(shù)( RVMI)的測(cè)定:右心室插管術(shù)后,迅速開(kāi)胸取出心臟。沿房室交界處剪去左右心房及大血管,分離右心室(RV)及左心室(LV)、室間隔(S),用濾紙吸去多余水分,分別稱重,計(jì)算RVMI=RV/(LV+S)。

    右心室心肌組織形態(tài)學(xué)檢測(cè):麻醉大鼠開(kāi)胸后迅速取出心臟,剪除大血管、心包膜、脂肪組織等,濾紙吸干,取右心室心肌靠心尖部組織塊,置于4%多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,蘇木素伊紅(HE)染色心肌切片,光鏡下觀察心肌病理改變。

    逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)TRPC1/3/4/5/6/7 mRNA表達(dá)水平:β肌動(dòng)蛋白及TRPC亞家族mRNA引物序列見(jiàn)表1,將約0.1 g右心室組織塊在液氮中充分研磨后,加入Trizol 試劑,提取總核糖核酸(RNA),紫外分光光度法測(cè)定RNA的濃度及純度。按照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT-PCR。用β肌動(dòng)蛋白(β-actin) 抗體作為內(nèi)參考進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR,建立一個(gè)10 μl PCR反應(yīng)體系:H2O 4.15 μl,染料ROX 5 μl,PCR Forward Primer 0.3 μl,PCR Reverse Primer 0.3 μl,互補(bǔ)脫氧核糖核苷酸(CDNA) 0.25 μl進(jìn)行PCR的擴(kuò)增反應(yīng):①預(yù)變性 95℃10 min(1cycle);②變性、退火、延伸95℃30s,60℃ 1min(40cycle)。

    表1 β肌動(dòng)蛋白及TRPC亞家族mRNA引物序列

    蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western-blot)檢測(cè)TRPC6蛋白表達(dá)水平:右心室心肌組織用液氮研磨后,加入RIPA細(xì)胞裂解液提取總蛋白,BCA法[6]測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,取40μg總蛋白進(jìn)行Western-blot實(shí)驗(yàn)。12.5 %聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳后行轉(zhuǎn)膜印跡,分別用兔抗大鼠TRPC6抗體或大鼠抗大鼠β-Actin抗體(Santa Cruz Biotechnology,美國(guó))與膜上的抗原結(jié)合,然后用相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)耦聯(lián)的二抗與其反應(yīng),用化學(xué)發(fā)光試劑Novex ECL(Invitrogen, 美國(guó))檢測(cè),經(jīng)壓片曝光后顯影和定影。采用Phoretix 1D圖像分析軟件分析各組蛋白表達(dá)情況。

    統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用統(tǒng)計(jì)軟件Origin 6.1對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,各組間均數(shù)比較采用成組t檢驗(yàn)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    兩組大鼠右心室血流動(dòng)力學(xué)和心室肥厚程度比較:MCT組與對(duì)照組比較, 右心室收縮壓、右心室肥大指數(shù)顯著升高,右心室內(nèi)壓力最大上升速率顯著增加,右心室內(nèi)壓力最大下降速率 顯著下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。兩組間平均體循環(huán)動(dòng)脈壓差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表2

    表2 兩組大鼠右心室血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)和右心室肥大指數(shù)的比較

    表2 兩組大鼠右心室血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)和右心室肥大指數(shù)的比較

    注:與對(duì)照組比較**P< 0.01。 RVSP:右心室收縮壓 mSAP:平均體循環(huán)動(dòng)脈壓 HR:心率 RV+dp/dtmax:右心室壓力最大上升速率 RV-dp/dtmax:右心室壓力最大下降速率 RVMI: 右心室肥大指數(shù)。1 mmHg=0.133 kPa

    對(duì)照組 MCT 組RVSP (mmHg) 29.77±5.97 60.83±5.18**mSAP (mmHg) 105.63±6.92 107.80±5.41 HR (beats/min) 366.00±32.00 372.00±69.00 RV+dp/dtmax(mmHg/s) 706.04±74.77 2174.03±280.56**RV-dp/dtmax(mmHg/s) -650.66±106.46 -1541.83±343.50**RVMI (%) 28.45±3.27 47.91±9.54**

    兩組大鼠病理學(xué)改變:HE染色可見(jiàn)對(duì)照組大鼠右心室心肌細(xì)胞排列有序,胞核清晰 (圖1A)。MCT組右心室心肌纖維粗大,細(xì)胞內(nèi)肌原纖維數(shù)量增多,心肌纖維排列紊亂,細(xì)胞核深染,形狀不整(圖1B)。

    圖1 兩組大鼠右心室心肌組織病理切片比較(蘇木素伊紅染色,×400)

    兩組大鼠右心室心肌組織TRPC6 mRNA表達(dá)的比較 :MCT組右心室心肌組織TRPC6 mRNA表達(dá)(2.46±1.24) 較對(duì)照組(1.00±0.28) 升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05, n=6)。圖2

    圖2 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)大鼠右心室TRPC亞家族mRNA相對(duì)表達(dá)水平( n=6)

    腹腔注射MCT 3周對(duì)右心室心肌組織TRPC6蛋白表達(dá)的影響:MCT組大鼠右心室TRPC6蛋白相對(duì)表達(dá)水平較對(duì)照組升高[ (2.02 ±0.47)vs(1.00±0.62)],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,n=4)。圖3

    圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)TRPC 6蛋白在大鼠右心室心肌組織的表達(dá) ( n=4)

    3 討論

    心肌肥厚是心臟的一種適應(yīng)性變化,表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積和重量的增加,最終可導(dǎo)致心力衰竭甚至死亡,目前用于研究心肌肥厚的動(dòng)物模型主要有異丙腎上腺素誘導(dǎo)法和腹主動(dòng)脈縮窄法等誘導(dǎo)左心室心肌肥厚模型。因臨床上肺源性心臟病非常常見(jiàn),且缺乏有效的治療手段,右心室是肺動(dòng)脈高壓預(yù)后的決定性因素,也是重要的治療靶點(diǎn)[7],故本文采用了MCT誘導(dǎo)右心室心肌肥厚模型。

    本課題采用MCT給藥3周的方式是借鑒了Tofovic 等[8]的研究結(jié)果,他們的研究發(fā)現(xiàn)MCT 誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓模型可以模擬人類原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓癥的發(fā)病過(guò)程。MCT屬雙稠吡咯啶生物堿,其進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后可在肝臟內(nèi)經(jīng)P450單氧化酶轉(zhuǎn)化為有活性的野百合堿吡咯,可選擇性地?fù)p傷肺動(dòng)脈的內(nèi)皮細(xì)胞,使內(nèi)皮源性的一氧化氮合成及分泌減少,而增加釋放了收縮血管的物質(zhì)如:ET(內(nèi)皮素)、PDGF(血小板源性生長(zhǎng)因子)、bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)等,引起肺動(dòng)脈血管腔狹窄甚至堵塞及肺動(dòng)脈血管收縮,同時(shí)由于內(nèi)皮細(xì)胞壞死脫落容易啟動(dòng)內(nèi)源性和外源性凝血途徑,形成血栓,最終誘導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓[9],本研究所采用的造模方法簡(jiǎn)單,可重復(fù)性好。

    目前的很多研究都已經(jīng)證實(shí)在大鼠肥大心肌細(xì)胞上能夠檢測(cè)到TRPC亞家族的表達(dá),這與本研究的結(jié)果一致,其中TRPC6 mRNA 及蛋白的表達(dá)水平在MCT組中發(fā)生顯著上調(diào)。目前已有研究表明TRPC6 通道在心肌肥厚中發(fā)揮了重要作用[10]。TRPC6是含有931個(gè)氨基酸的蛋白,它有六次跨膜的結(jié)構(gòu),其N端和C端均在胞內(nèi),它的第五和第六個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)構(gòu)成了非選擇性陽(yáng)離子通道[11], 目前的研究發(fā)現(xiàn)TRPC6的作用機(jī)制與鈉鈣交換體相關(guān)聯(lián)[12]。Kinoshita等[13]研究發(fā)現(xiàn)GC—A基因缺失后的小鼠,由于解除了GC—A對(duì)TRPC6的抑制作用引起了心臟中CaN/NFAT(鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶/激活T細(xì)胞核因子)信號(hào)通路的激活,從而導(dǎo)致了心肌肥厚。而本研究以不同的造模方式—MCT誘導(dǎo),進(jìn)一步證實(shí)了TPRC6通道的基因表達(dá)上調(diào)可能與心肌肥厚有關(guān)。

    本研究以MCT誘導(dǎo)的大鼠右心室心肌肥厚模型進(jìn)行研究,結(jié)果提示腹腔注射MCT3周可成功誘導(dǎo)大鼠形成右心室心肌增生肥厚,右心室收縮和舒張功能顯著增加;表明MCT誘導(dǎo)3周能成功建立SD大鼠右心室肥厚模型,并增強(qiáng)了右心室心肌收縮和舒張的功能。 MCT組大鼠右心室心肌組織上的TRPC6 mRNA表達(dá)顯著增加,在MCT注射后早期(第3天)TRPC6mRNA表達(dá)即出現(xiàn)顯著增強(qiáng),隨后(第5天)達(dá)到一個(gè)平臺(tái)期,并一直維持到3周,而其余TRPC亞型的mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著差異,在時(shí)間上亦無(wú)明顯動(dòng)態(tài)變化,MCT組大鼠TRPC6通道蛋白的表達(dá)顯著增加,提示TRPC6可能參與了心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展,TRPC6有可能成為治療肺源性心臟病的新靶點(diǎn)。

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    Effects of Monocrotaline on Right Ventricular Function and Expression of Cardiac Canonical Transient Receptor Potential Channels Subfamily in Experimental Rats

    CAI Ke-Feng, CHEN Hui-Qin, XU Xun-Fa, LIN Wei-Qiang, XU Chao-Xiang, CHEN Guo-Zhen.
    Department of Cardiology, The Second Aff i liated Hospital of Fujian Medical University, Quanzhou (362000), Fujian, China

    CHEN Hui-Qin, Email: hollerry@163.com

    Objective: To explore the effects of monocrotaline (MCT) on right ventricular function and expression of cardiac canonical transient receptor potential channels (TRPC) subfamily in experimental rats.Methods: The SD male rats were randomly divided into 2 groups: Control group, the rats were normally fed and MCT group, the rats received a single dose injection of MCT 60 mg/kg to induce myocardial hypertrophy. n=10 in each group and all animals were treated for 3 weeks. The right ventricular hemodynamics parameters and right ventricular hypertrophy index (RVHI) were measured, right ventricular myocardium tissue section was observed by HE staining, the mRNA and protein expressions of TRPC subfamily were examined by RT-PCR and Western blot analysis.Results: Compared with Control group, MCT group had increased RVSP, RVHI, RV+ dp/dtmaxand decreased RV-dp/ dtmax, all P<0.01. In MCT group, the right ventricular myocardial cells had the thinker fi ber, deeply stained nuclei with irregular shape. Compared with Control group, the mRNA and protein expressions of right ventricular TRPC6 were elevated in MCT group, n=6 and n=4 respectively, all P<0.05.Conclusion: Right ventricular hypertrophy could be induced by 3 weeks MCT treatment, it up-regulating the mRNA and protein expressions of TRPC6 which might be involved in the occurrence and development of cardiac hypertrophy inexperimental rats.

    Monocrotaline; Canonical transient receptor potential channels; Cardiac hypertrophy; Ca2+

    2014-04-30)

    (編輯:曹洪紅)

    362000 福建省泉州市,福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 心內(nèi)科(蔡克鋒、徐訓(xùn)發(fā)、林偉強(qiáng)、許朝祥、陳國(guó)楨);泉州醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)?;A(chǔ)醫(yī)學(xué)部生理教研室(陳慧勤)

    蔡克鋒 主治醫(yī)師 碩士 主要從事心血管臨床及基礎(chǔ)研究 Email: fjqzckf@yeah.net 通訊作者:陳慧勤 Email: hollerry@163.com

    R541

    A

    1000-3614(2014)11-0928-04

    10.3969/j.issn.1000-3614.2014.11.019

    方法:將20只SD雄性大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=10)和野百合堿誘導(dǎo)右心室肥大模型組(MCT組,n=10 )。MCT組以2% MCT 60 mg/kg 劑量一次性腹腔注射,建立MCT誘導(dǎo)的右心室肥厚大鼠模型。3周后,分別測(cè)定以上兩組的右心室血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)和右心室肥大指數(shù)(RVMI),右心室心肌病理切片,并通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白免疫印跡法(Western-blot)來(lái)檢測(cè)信使核糖核酸(mRNA)和TRPC亞型的蛋白表達(dá)水平。

    結(jié)果:MCT組與對(duì)照組比較, 右心室收縮壓、RVMI顯著升高,右心室內(nèi)壓力最大上升速率顯著增加,右心室內(nèi)壓力最大下降速率顯著下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);MCT組右心室心肌纖維增粗,細(xì)胞內(nèi)肌原纖維數(shù)量增多,心肌纖維排列紊亂,細(xì)胞核深染,形狀不整;MCT組較對(duì)照組右心室心肌組織TRPC6 mRNA表達(dá)升高,(n=6),右心室TRPC6蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高(n=4 ),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    結(jié)論:MCT預(yù)處理3周可誘導(dǎo)SD大鼠產(chǎn)生右心室心肌肥厚,上調(diào)了右心室心肌細(xì)胞TRPC6通道蛋白的mRNA和蛋白的表達(dá),TRPC6可能參與了心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展。

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