超聲提取樺黃多糖工藝及其多糖抗氧化性能研究

趙 鵬，安葉娟，宋 逍，張婷婷，王昌利

（陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西咸陽 712046）

超聲提取樺黃多糖工藝及其多糖抗氧化性能研究

趙 鵬，安葉娟，宋 逍，張婷婷，王昌利

（陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西咸陽 712046）

目的：優(yōu)化樺黃多糖的超聲提取工藝條件并初步探討其抗氧化性能。方法：在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以樺黃多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過響應(yīng)面分析方法確定樺黃多糖最佳超聲提取工藝條件；通過清除超氧陰離子自由基和DPPH自由基的實(shí)驗(yàn)來檢測多糖抗氧化性能。結(jié)果：樺黃多糖最佳超聲提取工藝條件為：溫度為62℃，超聲功率為220W，時(shí)間為35min，液料比為16∶1（mL/g），提取2次，在此優(yōu)化條件下多糖的平均提取率為7.87%，得到的樺黃多糖具有較好的抗氧化性能。結(jié)論：首次得到了一條適用于樺黃多糖超聲提取的工藝路線，與傳統(tǒng)工藝比較，超聲提取法具有提取快、提取率高的優(yōu)點(diǎn)。

樺黃，多糖，響應(yīng)面優(yōu)化法，超聲提取，抗氧化性

樺黃是多孔菌科滴孔菌屬植物樺滴孔菌（Piptoporus betulinus Karst）的 子 實(shí) 體[1]，其 主 要 生 長在海拔2300m以上發(fā)生病害的樺樹樹皮上，是陜西省民間習(xí)用藥材，具有消積、化疲、抗癌等功效，主要用于治療食管癌，胃癌，子宮癌等癥。藥理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，樺黃中的多糖成分具有較好的抗腫瘤活性，揭示多糖可能就是樺黃能夠治療腫瘤疾病中的主要活性成分，其在保健食品和醫(yī)藥應(yīng)用等方面具有很好的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。但目前對(duì)于樺黃多糖的研究主要集中在藥理實(shí)驗(yàn)方面[2-3]，對(duì)其提取、純化工藝的研究較少。為了更好地開發(fā)和利用這一藥用資源，本研究對(duì)樺黃多糖的提取工藝進(jìn)行了研究，由于超聲提取法具有提取時(shí)間短、效率高等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)在已經(jīng)成為提取領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一[5-6]。鑒于此本研究利用響應(yīng)面法優(yōu)化了超聲法輔助提取樺黃多糖的工藝條件，并初步測試了其抗氧化活性，研究取得了一定的成果，為更好地利用這一藥用資源提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樺黃 購自西安市萬壽路中藥材批發(fā)市場，經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院宋逍副教授鑒定為多孔菌科滴孔菌屬植物樺滴孔菌（Piptoporus betulinus Karst）的子實(shí)體；葡萄糖、無水乙醇、濃H2SO4、苯酚 均為分析純。

KQ-400DB型數(shù)控型超聲清洗器 江蘇昆山超聲有限公司；電子天平 梅特勒-托利多有限責(zé)任公司，精度：0.001g；EYELA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；UV-2550型紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樺黃多糖超聲提取工藝路線 先將干燥的樺黃粉碎，過60目篩，用無水乙醇進(jìn)行脫脂，然后將脫脂后的藥材顆粒置于圓底燒瓶中，并按設(shè)計(jì)的料液比加入蒸餾水，在超聲輔助的條件下進(jìn)行提取，提取完成后，提取液抽濾后，按原藥材質(zhì)量1∶1（g/mL）濃縮，加入一定量的無水乙醇，于冰箱中靜置過夜，抽濾，濾餅依次用無水乙醇、丙酮、乙醚淋洗，得疏松粉末后，真空干燥，即得樺黃粗多糖。

1.2.2 樺黃多糖含量與提取率測定 多糖含量的測定按照文獻(xiàn)[7]報(bào)道的苯酚-硫酸法，以葡萄糖為對(duì)照品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為：A=0.0103C+0.0004，相關(guān)系數(shù)r= 0.9991，濃度范圍在0～50μg/mL，線性良好。

多糖提取率的計(jì)算用下式：

1.2.3 樺黃多糖提取單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響 精確稱取五份各50g的干燥樺黃，每份液料比為10∶1（mL/g），提取時(shí)間25min，超聲功率120W，提取2次，分別考察不同提取溫度（40、50、60、70、80℃）對(duì)樺黃多糖提取率的影響。

1.2.3.2 超聲功率對(duì)多糖提取率的影響 精確稱取五份各50g的干燥樺黃，每份液料比為10∶1（mL/g），提取時(shí)間25min，提取溫度60℃，提取2次，分別考察不同超聲功率（120、160、200、240、280W）對(duì)樺黃多糖提取率的影響。

1.2.3.3 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響 精確稱取五份各50g的干燥樺黃，每份液料比為10∶1（mL/g），超聲功率200W，提取溫度60℃，提取2次，分別考察不同提取時(shí)間（25、30、35、40、45min）對(duì)樺黃多糖提取率的影響。

1.2.3.4 液料比對(duì)多糖提取率的影響 精確稱取五份各50g的干燥樺黃，每份超聲功率200W，提取時(shí)間35min，提取溫度60℃，提取2次，分別考察不同液料比（6∶1、10∶1、14∶1、18∶1、22∶1（mL/g））對(duì)樺黃多糖提取率的影響。

1.2.3.5 提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響 精確稱取50g的干燥樺黃，每份液料比為14∶1（mL/g），超聲功率200W，提取溫度60℃，提取時(shí)間25min，考察不同提取次數(shù)（1、2、3、4次）對(duì)樺黃多糖提取率的影響。

1.2.4 樺黃多糖超聲提取工藝條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 利用Box-Behnken響應(yīng)面法，對(duì)樺黃多糖的超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，選擇對(duì)多糖提取率影響較大的因素，超聲功率、提取溫度、時(shí)間及液料比進(jìn)行研究，提取次數(shù)均定為2次，確定樺黃多糖的最優(yōu)超聲提取工藝條件。實(shí)驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)如表1所示。

1.2.5 樺黃多糖熱水浸提工藝 為了對(duì)比超聲提取工藝的優(yōu)劣性，本研究在液料比10∶1（mL/g），提取溫度為80℃，提取時(shí)間為120min的條件下，對(duì)樺黃進(jìn)行了熱水浸提法提取。

1.2.6 抗氧化性能測試 參照文獻(xiàn)[7]測試樣品對(duì)超氧陰離子自由基和DPPH自由基的清除效果。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of the designed experiment

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)各個(gè)因子對(duì)提取率的影響

2.1.1 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響 從圖1可以看出，當(dāng)提取溫度在60～70℃時(shí)，多糖的提取率達(dá)到最高值，其后多糖提取率改變不大，因此確定多糖的提取溫度為60℃左右。

圖1 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig.1 Effects of extraction temperature on extraction ratio

2.1.2 超聲功率對(duì)多糖提取率的影響 從圖2可以看出，多糖的提取率隨著超聲功率的增加先是快速增大，當(dāng)超聲功率達(dá)到200W時(shí)，多糖的提取率達(dá)到最高值，其后多糖提取率呈逐步下降趨勢，因此確定多糖的提取功率為200W左右。

圖2 超聲功率對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 Effects of ultrasound power on extraction ratio

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響 從圖3可以看出，當(dāng)提取溫度在35～40min時(shí)，多糖的提取率達(dá)到最高值，其后多糖提取率改變不大，因此確定多糖的提取溫度為35min左右。

2.1.4 液料比對(duì)多糖提取率的影響 從圖4可以看出，當(dāng)液料比在14∶1～18∶1（mL/g）時(shí)，多糖的提取率達(dá)到最高值，其后多糖提取率改變不大，因此確定多糖的提取溫度為14∶1（mL/g）左右。

2.1.5 提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響 從圖5可以看出，當(dāng)提取次數(shù)為2次時(shí)，多糖的提取率達(dá)到最高值，其后多糖提取率幾乎不再改變，因此確定多糖的提取次數(shù)為2次。

圖3 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.3 Effects of extraction time on extraction ratio

圖4 液料比對(duì)多糖提取率的影響Fig.4 Effects of extraction ratio of water to material on extraction ratio

圖5 提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響Fig.5 Effects of extraction time on extraction ratio

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與多糖提取率預(yù)測方程

按照表1的設(shè)計(jì)方案，利用Design-Expert v7.1.3軟件進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，總計(jì)有27組實(shí)驗(yàn)方案組合，其中的24組是析因?qū)嶒?yàn)，3組是中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，用來評(píng)估整個(gè)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)的誤差。

采用Design-Expert 7.01軟件對(duì)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果進(jìn)行研究，研究結(jié)果見表2，按照各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響進(jìn)行二次方程擬合，擬合得到下式：

表2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 2 Program and test results of RSM

由方差分析表3的分析結(jié)果可以看出，回歸方程的F值為10.12，其顯著水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于0.05，這說明，利用響應(yīng)面法擬合得到的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ惋@著型極高，按照擬合模型得到的回歸方程，考察其因變量與自變量之間的線性相關(guān)系數(shù)后發(fā)現(xiàn)，r=5.04/5.05=0.998，這一點(diǎn)表明用該數(shù)學(xué)模型來評(píng)估各相關(guān)因素對(duì)樺黃多糖的提取率的影響比較真實(shí)可靠。由F值可知，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)組合的各單因素中，對(duì)樺黃多糖提取率影響最大的是超聲功率，其次為溫度、液料比，提取時(shí)間的影響最小且為不顯著影響因素。

2.3 響應(yīng)面圖分析

從表3的分析結(jié)果可知，六組提取因素的交互影響中，僅提取溫度與時(shí)間之間的交互影響顯著，因此對(duì)這組交互影響顯著的響應(yīng)面圖進(jìn)行了分析。

從圖6可以直觀的看出，在提取時(shí)間較短時(shí)升高提取溫度，或在提取溫度較低時(shí)延長提取時(shí)間（D）均可提高樺黃多糖的提取率；但提取時(shí)間較長時(shí)，升高提取溫度，多糖的提取率又呈下降趨勢，這可能是因?yàn)檩^高溫度下，提取時(shí)間過長，引起的多糖水解造成的。

通過響應(yīng)面法預(yù)測得到的回歸模型分析[8]，可得到按照回歸模型預(yù)測的超聲提取法提取樺黃多糖的最優(yōu)工藝條件是：溫度為62℃，超聲功率為215.6W，時(shí)間為34.65min，液料比為16.08∶1（mL/g），提取次數(shù)為2次，在此工藝條件下，預(yù)測提取得到樺黃多糖提取率為7.90%。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

圖6 提取溫度與時(shí)間對(duì)多糖提取率的交互影響Fig.6 Effects of time and ratio of water to material on the extraction

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)預(yù)測的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并從實(shí)際工藝操作方便考慮，微調(diào)提取的最佳工藝條件為：溫度為62℃，超聲功率為220W，時(shí)間為35min，液料比為16∶1（mL/g），提取2次，在此工藝條件下重復(fù)操作三次，同時(shí)為了對(duì)比超聲提取法和熱水浸提法的優(yōu)劣，也對(duì)樺黃多糖采用熱水浸提法進(jìn)行了三次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。

從表4可看出，超聲條件下樺黃多糖的平均提取率為7.87%，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值基本相符，由此可知，通過響應(yīng)面法預(yù)測得到的方程與實(shí)際結(jié)果高度一致，具有很高的可信性。與熱水浸提法相比，采用超聲提取法，多糖的提取時(shí)間大幅度縮短，提取率有了較大程度的提高。

表4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of the experiment

2.5 抗氧化性能分析

2.5.1 樺黃多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用 本實(shí)驗(yàn)分別考察熱水浸提法、超聲提取法得到的樺黃多糖清除超氧陰離子自由基的效果，結(jié)果如圖7所示。

由圖7可看出，超聲提取法得到的樺黃多糖對(duì)超氧陰離子的清除效果強(qiáng)于熱水浸提法得到的樺黃多糖，并且隨著濃度的增大而逐漸增大，呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系，其最大清除率達(dá)88.31%。

2.5.2 樺黃多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用 本實(shí)驗(yàn)分別考察熱水浸提法、超聲提取法得到的樺黃多糖清除DPPH自由基的效果，結(jié)果如圖8所示。

圖8 DPPH自由基清除作用Fig.8 The savenging of DPPH radical

由圖8可看出，超聲提取法得到的樺黃多糖對(duì)DPPH·的清除作用的清除效果同樣強(qiáng)于熱水浸提法得到的樺黃多糖，并且隨著濃度的增大而逐漸增大，呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系，其最大清除率達(dá)98.2%。

3 結(jié)論

本研究首次利用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)樺黃多糖的超聲提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究，最終得到了和實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬和程度較高的數(shù)學(xué)模型和較優(yōu)的樺黃多糖超聲提取工藝條件：溫度為62℃，超聲功率為220W，時(shí)間為35min，液料比為16∶1（mL/g），提取2次，在此工藝條件下重復(fù)操作三次，樺黃多糖的平均提取率為7.87%。

研究同時(shí)比較了超聲提取法得到的樺黃多糖和熱水浸提法得到的樺黃多糖的抗氧化性能，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，這兩種樺黃多糖均具有較好的抗氧化活性，而超聲提取法得到的多糖其抗氧化能力較強(qiáng)，出現(xiàn)這一原因的可能是因?yàn)槌晫?duì)多糖的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的影響，對(duì)于其現(xiàn)象產(chǎn)生的原因，還在進(jìn)一步研究之中。

結(jié)果表明，超聲提取法與熱水浸提法相比，具有提取時(shí)間短，提取溫度低，多糖提取率高的優(yōu)點(diǎn)，本研究結(jié)果為樺黃多糖提取工藝的進(jìn)一步深入研究提供一定的參考價(jià)值。

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Study on ultrasonic wave extraction and antioxidant of polysaccharides from Piptoporus betulinus Karst

ZHAO Peng，AN Ye-juan，SONG Xiao，ZHANG Ting-ting，WANG Chang-li
（School of Pharmacy，Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang 712046，China）

Objective：To select the optimum extracting with the assistance of ultrasonic method of polysaccharides from Piptoporus betulinus Karst.Methods：The response surface analysis was employed to determine the optimum technological condition.Results ： The optimum extraction conditions were as follows ： extraction temperature 62℃ ，ultrasonic power 220W，extraction time 35min，ratio of water to raw material 16 ∶1mL/g and 2 times.The yield of polysaccharides was 7.87%based on the above conditions.Conclusion：This method was suitable for the ultrasonic extraction and determination of polysaccharides from Piptoporus betulinus Karst. Compared with the traditional methods，ultrasonic extraction method was time-saving and efficiency.

Piptoporus betulinus Karst；polysaccharides；response surface methodology；ultrasonic extraction extraction；antioxidant

TS201.2

B

1002-0306（2014）20-0252-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.047

2013－12－23

趙鵬（1977-），男，博士，副教授，研究方向：天然藥用活性成分分離純化。

陜西省教育廳專項(xiàng)（11JK0691）資助項(xiàng)目；陜西省中藥制藥重點(diǎn)學(xué)科專項(xiàng)基金。