松木層孔菌多糖PP60-S1分離、結構表征及抗氧化活性研究

楊 開，金月忠，邢 辰，胡江寧，王如偉，孫培龍，*

（1.浙江工業(yè)大學食品科學與工程系，浙江杭州 310014；2.浙江中藥與天然藥物研究院，浙江杭州 310052）

松木層孔菌多糖PP60-S1分離、結構表征及抗氧化活性研究

楊 開1，2，金月忠1，邢 辰1，胡江寧2，王如偉2，孫培龍1，*

（1.浙江工業(yè)大學食品科學與工程系，浙江杭州 310014；2.浙江中藥與天然藥物研究院，浙江杭州 310052）

松木層孔菌子實體水提物經(jīng)乙醇分級醇沉和DEAE-Sepharose Fast Flow離子柱層析及Sephacryl S-300凝膠柱層析純化，獲得均一多糖PP60-S1，其分子量為3.56×104u，是由葡萄糖、甘露糖和半乳糖組成的雜多糖，單糖摩爾比為9.24∶1.00∶0.76，甲基化分析PP60-S1主要由1-Glc、1，3-Glc、1，6-Glc、1，3-Gal、1，6-Gal、1，3，6-Man 6種糖苷鍵連接方式，主鏈主要由1，6-Glc構成。PP60-S1的體外抗氧化活性研究表明其具有一定的DPPH自由基和ABTS+自由基清除活性以及FRAP總抗氧化能力。

松木層孔菌，多糖，分離純化，結構表征，抗氧化

松木層孔菌（Phellinus pini），又名松針層孔菌和松白腐菌，是針層孔菌屬真菌，屬于大型真菌，子實體木質，呈褐色。其主要活性成分有多糖、酚類、萜類物質等[1-2]。多糖作為松木層孔菌的主要生物活性成分之一，在抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗腫瘤等方面均表現(xiàn)出了較好的效果[3-4]。在松木層孔菌發(fā)酵物多糖研究方面，裴麗娟等[5]從發(fā)酵菌絲體中分離得到了一種由甘露糖、半乳糖和葡萄糖構成的堿提水溶性多糖（PEP），此多糖對小鼠離體淋巴細胞具有較顯著的促增殖作用。袁蕾等[6]從發(fā)酵液中分離得到了一種胞外多糖（PPE），是以甘露糖（93.29%）為主要組成的雜多糖組分。在子實體多糖研究方面，劉安軍等[7]提取分離得到的水溶性β-雜多糖組分PS1，能夠顯著提高小鼠機體的免疫能力。Lee等[8]從松木層孔菌子實體中分離得到了兩種高分子量的多糖（EP-AV1和EP-AV2），均以β-1，3葡聚糖構成為主，并具有一定的抗病毒活性（包括HSV-1和CVB3）。近幾十年的研究表明，一種來源的菌物多糖往往由幾個不同結構的多糖組成，而且多糖的結構（如分子量、連接方式、糖苷鍵類型、分支度和聚合度等）是其發(fā)揮各種生理活性的物質基礎。然而與同屬的其他真菌相比，如裂蹄 針 層 孔 菌（Phellinus linteus）、針 層 孔 菌（Phellinus igniarius）和鮑氏針層孔菌（Phellinus baumii），目前有關松木層孔菌多糖結構特性的研究還很少。因此，本文進行了松木層孔菌子實體多糖的提取和分離純化，并對一個純化多糖組分開展了結構表征和體外抗氧化活性研究，有利于進一步了解該珍稀菌物多糖的結構和生物活性，也為其醫(yī)藥保健產(chǎn)品的研發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

松木層孔菌子實體（Phellinus pini） 購于浙江五養(yǎng)堂藥業(yè)有限公司，由浙江省農(nóng)科院園藝研究所食藥用菌研究室蔡為明研究員鑒定；DEAE-Sepharose Fast Flow 、Sephadex G-25 Fine 和 Sephacryl S300 High-Resolution 均購自美國GE公司；葡聚糖標準品（analytical standard for GPC，CAS：9004-54-0）、單糖標準品：L-巖藻糖（≥99%，CAS：2438-80-4）、D-木糖（≥99%，CAS：58-86-6）、D-甘露糖（≥99%，CAS：3458-28-4）、L-鼠李糖 （≥99%，CAS：10030-85-0）、D-半乳糖（≥99%，CAS：59-23-4）、D-葡萄糖（≥99.5%，CAS：50-99-7）、碘甲烷、2，2-Diphenyl-picrylhydrazyl（DPPH）、2，2-Azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） diammonium salt（ABTS）、2 ，4 ，6-Tris（2-pyridyl）-s-triazine（TPTZ） 均 購 自 美 國 Sigma公司；三氟乙酸、硼氫化鈉 購于德國Merck公司；其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

RE-2000A旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；CR21GⅡ型高速冷凍離心機 日本日立儀器有限公司；UV-2450紫外可見分光光度儀 日本島津公司；Alpha 2-4 LD Plus真空冷凍干燥機 德國Christ公司；Waters 1525高效液相色譜儀、Waters 2414示差檢測器 美國Waters公司；TSKgel G4000PWXL高效液相色譜柱 日本Tosoh公司；XK雙層層析柱（26mm× 100cm） 美國GE公司；Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀、Finnigan Trace Ultra-DSQⅡ氣-質聯(lián)用色譜儀 美國Thermo公司；Agilent 7890A氣相色譜 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 松木層孔菌子實體多糖的提取 松木層孔菌子實體切成小塊后用粉碎機粉碎，過60目篩，60℃烘干至恒重，稱取干燥粉末500g，用10倍體積95%乙醇浸提過夜脫脂，布氏漏斗過濾，重復3次。殘渣置陰涼通風處風干，加20倍蒸餾水，沸水提取2h，10000r/min離心10min，渣液分離，濾渣復提2次，合并3次提取液，50℃以下減壓旋轉蒸發(fā)濃縮，濃縮液攪拌過程中緩慢加入95%乙醇至終乙醇體積濃度為30%，靜置過夜，10000r/min，離心10min；上清液繼續(xù)加入95%乙醇至終乙醇體積濃度為60%，10000r/min，離心10min，收集沉淀，醇沉物再經(jīng)無水乙醇、丙酮洗滌，72h冷凍干燥后得松木層孔菌子實體粗多糖，命名為PP60。

1.2.2 松木層孔菌子實體多糖的分離與純化 將粗多糖PP60溶于蒸餾水中，配成1.0mg/mL溶液，10000r/min離 心10min，取 上 清 液 經(jīng) DEAE-Sepharose Fast Flow離子柱（XK26mm×100cm）層析，每次上樣10mL，流速3.0mL/min，依次用蒸餾水，0～0.4mol/L NaCl溶液線性梯度洗脫，自動部分收集，每管10mL，糖含量經(jīng)苯酚-硫酸法跟蹤檢測，根據(jù)顯色反應收集多糖組分。離子柱洗脫下來的多糖組分PP60-S配成一定濃度的糖 溶 液 后 經(jīng)Sephadex G-25 Fine凝 膠 柱（XK26mm × 100cm）脫鹽，收集全部脫鹽后的PP60-S多糖溶液 ，再 用 Sephacryl S-300 High-Resolution 凝 膠 柱（XK26mm×100cm）進一步純化，蒸餾水洗脫，自動部分收集，得到PP60-S1組分，收集，濃縮，凍干，儲存于干燥器中備用。

1.2.3 多糖PP60-S1的均一性和平均分子量測定 采用高效液相色譜法（HPLC）對松木層孔菌純化多糖PP60-S1進行均一性及分子量的測定。色譜柱：TSKgel G4000PWXL（7.8 ×300mm）；流 動 相 ：0.1mol/L NaNO3溶液，流速：0.8mL/min；進樣量：10μL；柱溫：（30±1）℃；檢測器：Waters 2414示差檢測器。取多糖PP60-S1 2.0mg溶于2.0mL 0.1mol/L NaNO3溶液，微孔濾膜過濾，取濾液10μL進樣，測得保留時間，根據(jù)標準曲線計算分子質量。

1.2.4 多糖PP60-S1的理化特性分析

1.2.4.1 多糖PP60-S1的紫外-可見光光譜全掃描檢測 將PP60-S1配成1.0mg/mL水溶液，采用紫外-可見分光光度計在200～400nm進行全波長掃描檢測。

1.2.4.2 多糖PP60-S1的傅里葉變換紅外光譜分析 取2.0mg干燥的PP60-S1樣品，采用KBr壓片，在4000～400cm-1內(nèi)進行紅外光譜掃描。

1.2.5 多糖PP60-S1的單糖組成分析 稱取PP60-S1樣品2.0mg，放入薄壁長試管中，加入2.0mol/L的三氟乙酸（TFA）4.0mL，在110℃水解2h。水解后，試管中溶液低于40℃減壓蒸干，然后加入甲醇蒸干，重復操作4～5次，以完全除去TFA。將完全水解的樣品重新溶于3.0mL蒸餾水中，加入20～30mg硼氫化鈉（NaBH4），密塞，室溫下還原3h，然后用冰醋酸中和過量的NaBH4，加入少量甲醇，減壓濃縮蒸干，重復4～5次，真空干燥過夜。次日，加入4.0mL醋酐，100℃反應1h，然后加入3.0mL甲苯，減壓蒸干。將乙酰化后的產(chǎn)物用氯仿溶解后轉移至分液漏斗，加入等量的蒸餾水充分混勻，靜置分層后，除去上層水溶液，重復3～4次。氯仿層以適量無水硫酸鈉干燥、過濾，定容至10mL，待GC分析。

色譜條件：Agilent 7890N儀器配備HP-5毛細管柱（30m ×0.32mm ×0.25μm），氫 火 焰 離 子 化 檢 測 器（FID），高純度氮氣最為載氣。程序升溫：初始柱溫為120℃，以10℃/min升溫至240℃，恒溫6.5min，進樣量2.0μL，進樣口溫度為250℃，分流比1∶50，檢測器溫度為250℃，氫氣流速為35mL/min，空氣流速350mL/min，尾吹氣流速30mL/min，柱內(nèi)流速為1.0mL/min。

1.2.6 多糖PP60-S1的糖苷鍵連接方式分析 充分干 燥 的 樣 品 2.0mg，加 入 0.5mL DMSO，水 浴 超 聲2min，然后加入0.025g/mL NaOH-DMSO懸液0.6mL和0.6mL碘甲烷，密封、渦旋混合器上混合7min后加入4.0mL蒸餾水終止反應，用等量的氯仿進行萃取，棄去上層水相，下層有機相用蒸餾水萃取5次，有機相40℃下減壓蒸干，用IR檢查至3400cm-1處無-OH吸收峰，即得完全甲基化多糖。將甲基化多糖溶于甲酸溶液中，100℃下解聚3h。再用TFA在100℃下封管水解6h后用NaBH4進行還原，再將上述處理過的樣品用醋酐進行乙?；磻Ｒ阴；蟮漠a(chǎn)物用等體積氯仿和蒸餾水進行萃取，待GC-MS分析。

色譜條件：Finnigan Trace Ultra-DSQⅡ氣-質聯(lián)用色譜儀配備DB-5毛細管柱（30m×0.25mm×0.25μm）。程序升溫：初始柱溫為120℃，以10℃/min升溫至240℃，保持6.5min，接口溫度為250℃，離子源溫度為250℃，進樣量2.0μL，以氦氣做載氣，流速為1.0mL/min。

1.2.7 多糖PP60-S1的體外抗氧化活性測定

1.2.7.1 清除DPPH自由基活性測定 測定方法參考Milardovic等[9]的報道并略有改動。用80%甲醇溶液配制成0.2mmol/L的DPPH試劑，取1.0mL稀釋的提取液與3.0mL DPPH試劑混合，暗處反應1h，然后在515nm下測定吸光值。以80%甲醇溶液作為空白對照。其結果表達為清除率達到50%時所對應的多糖濃度（即EC50）。

式中：A0：空白對照的吸光值；A1：樣品的吸光值。

1.2.7.2 清除ABTS+·活性測定 測定方法參考Miller等[10]的報道并略有改動。取140mmol/L的過硫酸鉀溶液加入到7.0mmol/L的ABTS溶液中混合，暗處反應12～16h。測定前用無水乙醇將ABTS+·溶液稀釋至吸光值為0.70±0.02（734nm）。取0.2mL稀釋過的提取液與 3 .8mL 的 ABTS+·溶 液 混 合 搖 勻 ，在 室 溫 下 反 應10min后，在734nm下測定吸光值。以80%甲醇溶液作為空白對照。其結果表達為清除率達到50%時所對應的多糖濃度（即EC50）。清除率公式同1.2.7.1。

1.2.7.3 FRAP總抗氧化活性測定 測定方法參照Benzie等[11]的 報 道 并 略 有 改 動 。FRAP 試 劑 的 準 備 ：0.1mol/L的醋酸緩沖試劑（pH3.6），19mmol/L的TPTZ，20mmol/L氯化鐵按體積10∶1∶1的體積比混合。3.9mL FRAP試劑工作液加入0.1mL稀釋過的提取液，混合均勻，置37℃恒溫水浴10min，然后在593nm下測其吸光值。以FeSO4為標準溶液（標準曲線：y=0.5450x-0.0031，R2=0.9992），根據(jù)反應后的吸光值，在標準曲線上求得相應的FeSO4的濃度，定義為FRAP值，結果以每毫克多糖相當FeSO4還原力的相當量表示（mmol FeSO4/mg多糖），F(xiàn)RAP值越大，抗氧化活性越強。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 所有實驗數(shù)據(jù)重復測定3次，所得結果 以 平均 值 ±標 準 差（±s）來 表示，采用Origin 8.5軟件進行繪圖與數(shù)據(jù)的分析。

2 結果與分析

2.1 松木層孔菌多糖PP60-S1的分離純化

經(jīng)乙醇脫脂的松木層孔菌子實體粉末，熱水浸提，乙醇沉淀后得到粗多糖PP60，其得率為6.29%（w/w），經(jīng)苯酚-硫酸法測定，總糖含量為66.32%±3.61%。PP60 經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow離 子 柱 層 析 后 得到3個組分：PP60-W（蒸餾水洗脫）、PP60-S（0.1mol/L NaCl溶 液 洗 脫）和PP60-S-1（0.2mol/L NaCl溶 液 洗脫）。洗脫曲線如圖1所示。收集含量較多組分PP60-S，經(jīng)Sephadex G-25 Fine凝膠柱脫鹽后，再經(jīng)Sephacryl S-300 High-Resolution（圖2）進一步純化后得到純化組分PP60-S1，收集、濃縮、冷凍干燥后得到白色固體粉末。

圖1 PP60 DEAE-Sepharose Fast Flow離子柱層析洗脫曲線Fig.1 Elution curves of PP60 by DEAE-Sepharose Fast Flow column chromatography

圖2 PP60-S脫鹽后Sephacryl S300洗脫曲線Fig.2 Elution curves of desalted PP60-S by Sephacryl S300 column chromatography

2.2 多糖PP60-S1的純度及平均分子質量測定結果

標準曲線用標準葡聚糖（分子量分別為1.0、5.0、12、50、80、150、270、670ku） 的保留時間進行繪制。以分子量的對數(shù)為縱坐標（y），保留時間為橫坐標（x，min），繪制得標準曲線：y=-0.4925x+10.071，R2= 0.9953。

PP60-S1經(jīng)HPLC檢測為單一對稱峰（圖3），說明PP60-S1為均一多糖，根據(jù)保留時間及標準葡聚糖分子量曲線，計算其平均分子質量為3.56×104u。經(jīng)苯酚-硫酸法測定，PP60-S1總糖含量為99.07%± 0.28%。

圖3 PP60-S1 HPLC曲線Fig.3 HPLC determination of PP60-S1

2.3 紫外-可見光光譜全掃描檢測結果

松木層孔菌多糖PP60-S1的紫外-可見光譜全掃描結果見圖4所示。其顯示在210nm波長左右處有強的多糖吸收峰，而在260nm和280nm波長處未發(fā)現(xiàn)核酸和蛋白質等雜質峰，表明PP60-S1不含核酸和蛋白質。

圖4 PP60-S1紫外全掃描光譜圖Fig.4 UV scanning curve of PP60-S1

2.4 傅里葉變換紅外光譜分析

PP60-S1在4000～400cm-1區(qū)具有多糖官能團特征吸收峰（圖5）。由圖5可見，3412.8cm-1的寬而強的吸收峰是糖分子中-OH基團的伸縮振動吸收峰；2928.0cm-1的吸收峰是C-H的伸縮振動峰；1658.0cm-1附近的吸收峰是多糖的水合振動峰；1378.8cm-1左右的吸收峰是C-H的彎曲振動吸收峰；1076.5cm-1的吸收峰為C=O伸縮振動特征峰，包括吡喃糖環(huán)的C-O-C伸縮振動和吡喃環(huán)中與羥基連接的C-O伸縮振動，說明其中的單糖以吡喃糖苷的形式存在[12-13]；1730cm-1及1258cm-1附近沒有特征吸收峰，表明該糖不含糖醛酸[14]。

圖5 PP60-S1的紅外光譜圖Fig．5 FT-IR spectrum of PP60-S1

2.5 多糖PP60-S1的單糖組成分析

混合單糖標準品和PP60-S1乙?；苌餁庀嗌V圖見圖6。根據(jù)圖6（b）得出，多糖PP60-S1組成單糖有三種，與標準單糖保留時間對比圖6（a），根據(jù)保留時間順序為甘露糖、葡萄糖和半乳糖，葡萄糖含量明顯大于甘露糖和半乳糖。樣品中三種糖的摩爾比為甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖=1.00∶9.24∶0.76。這一結果與文獻報道的松木層孔菌發(fā)酵菌絲體胞外多糖（主要由甘露糖組成）相比存在明顯的差異[6]。

圖6 乙酰化衍生物氣相色譜圖Fig.6 Gas chromatogram of acetyl derivatives

2.6 多糖PP60-S1的糖苷鍵連接方式分析

PP60-S1經(jīng)甲基化、酸水解、還原及乙?；杉谆谴家宜狨パ苌?，對其進行GC-MS分析。根據(jù)相應保留時間的碎片離子峰和相關文獻[15-19]對比得出PP60-S1的甲基化多糖及單糖連接位點歸納如表1所示。甲基化糖醇衍生物中占絕大部分的為2，3，4-Me3-Glcp，說明多糖PP60-S1分子的主鏈可能主要是通過1，6葡萄糖糖苷鍵連接組成，而且結構中還存在末端Glc。計算得到的甲基化單糖摩爾比與GC分析得出的單糖摩爾比基本符合，主要由葡萄糖組成，證明推斷合理。從1-Glc和1，3，6-Man的摩爾比（1∶1）看，兩者可能是相互連接的。

2.7 多糖PP60-S1的體外抗氧化活性測定結果

多糖PP60-S1的體外抗氧化活性結果見表2。結果發(fā)現(xiàn)在實驗的濃度范圍內(nèi)，松木層孔菌多糖PP60-S1對DPPH和ABTS+·自 由 基 的 清 除 率 均 隨 濃 度 增加而增加，呈量效關系，對DPPH自由基的半清除濃度（EC50）為 4.18mg/mL；對 ABTS+·自 由 基 的 半 清 除 濃度（EC50）為7.62mg/mL；反映總抗氧化能力的FRAP值為0.18mmol FeSO4/mg多糖。通過體外抗氧化活性的研究，發(fā)現(xiàn)松木層孔菌子實體純化多糖PP60-S1具有一定的清除DPPH和ABTS+自由基活性和FRAP總抗氧化能力，但不及文獻報道的松木層孔菌子實體粗多 糖 體 外 抗 氧 化 活 性[20]，其 原 因 可 能 與 提 取 的 粗 多糖（未經(jīng)純化）連有蛋白質、核酸、酚類化合物等其他 活 性 成 分[21-22]有 關 ，其 具 體 原 因 需 要 進 一 步 研 究證實。

表1 松木層孔菌多糖PP60-S1的甲基化分析結果Table 1 Methylation analysis of Phellinus pini polysaccharide PP60-S1

表2 松木層孔菌多糖PP60-S1體外抗氧化活性結果Table 2 In vitro antioxidant activities of Phellinus pini polysaccharide PP60-S1

3 結論與討論

真菌多糖主要存在于真菌子實體、菌絲體和發(fā)酵培養(yǎng)液中，并具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、降血壓、降血脂、降血糖等。作為一種天然的生物大分子，真菌多糖因其優(yōu)良的生物活性和無毒性的特點，成為了生物學和醫(yī)學領域的研究熱點。本實驗通過對松木層孔菌子實體粗多糖的提取和分離純化，獲得了一種均一性較好的水溶性多糖PP60-S1，此多糖主要由葡萄糖、甘露糖和半乳糖組成，其摩爾比為9.24∶1.00∶0.76。與文獻已報道的松木層孔菌發(fā)酵菌絲體堿提多糖[5]和胞外多糖[6]（主要由甘露糖組成）相比存在明顯的差異，與劉安軍[7]和Lee等[8]提取到的子實體多糖單糖組成較相符。經(jīng)甲基化和GC-MS初步分析，PP60-S1主要由1，6-Glc構成，還存在少量其他的糖苷鍵，與Lee等得到的多糖組分EP-AV1和EP-AV2（以β-1，3葡聚糖為主）有一定的差別。另外，通過3種體外實驗模型研究了松木層孔菌子實體多糖PP60-S1的體外抗氧化活性。結果表明，多糖PP60-S1對DPPH自由基和ABTS+自由基均表現(xiàn)出一定的清除活性以及FRAP總抗氧化能力。目前有研究表明，對具有抗氧化活性的多糖進行硫酸化、硒化及酯化等結構修飾和改造后，所得的修飾多糖抗氧化活性將會有較大的改善[23-24]，因此通過對松木層孔菌多糖結構進行改造和修飾，有望得到一種更加安全高效和經(jīng)濟實用的天然抗氧化劑產(chǎn)品，對于松木層孔菌資源的開發(fā)利用具有一定的意義。

[1]Jang H J，Yang K S.Inhibition of nitric oxide production in RAW 264.7 macrophages by diterpenoids from Phellinus pini[J]. Archives of Pharmacal Research，2011，34（6）：913-917.

[2]William A A，David J M，Priyotosh C.Phenolic and other metabolites of Phellinus pi ni，a fungus pathogenic to pine[J]. Phytochemistry，1996，42（5）：1321-1342.

[3]王穩(wěn)航，李玉劉，安軍.松木層孔菌多糖的提取及抗氧化性研究[J]. 食品研究與開發(fā)，2006，27（11）：53-55.

[4]王穩(wěn)航，李玉，劉安軍.松木層孔菌多糖對正常小鼠體內(nèi)抗氧化功能的影響[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2008，8（8）：1439-1441.

[5]裴麗娟，袁蕾，馬姣妮，等.松木層孔菌多糖PEP的結構及活性研究[J]. 分子科學學報，2010，26（2）：103-107.

[6]袁蕾，劉瑜，田法益，等. 松木層孔菌（Phellinus pini）胞外多糖結構解析[J]. 中國藥學雜志，2013，48（8）：597-600.

[7]劉安軍，任寅，王穩(wěn)航，等. 水 溶性Phellinus pini多糖PS1的分離提取及免疫活性研究[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2006，6（11）：14-17.

[8]Lee S M，Kim S M，Lee Y H，et al.Macromolecules isolated from Phellinus pini fruiting body：Chemical characterization and antiviral activity[J].Macromolecular Research ，2010 ，18（6）：602-609.

[9]Milardovic S，Ivekovic D，Grabaric B S.A novel amperometric method for antioxidant activity determination using DPPH free radical[J].Bioelectrochemistry，2006，68（2）：175-180.

[10]Miller N J，Rice E C，Davies M J，et al.A novel method for measuring antioxidant status in premature neonates[J].Clinical Science，1993，84（4）：407-412.

[11]Benzie I F F，Strain J J.The ferric reducing ability of plasma（FRAP） as a measure of“antioxidant power”：the FRAP assay [J].Analytical Biochemistry，1996，239（1）：70-76.

[12]Luo J G，Liu J，Ke C L，et al.Optimization of medium composition forthe production ofexopolysaccharidesfrom Phellinus baumii Pilát in submerged culture and the immunostimulating activity of exopolysaccharides[J].Carbohydrate Polymers，2009，78：409-415.

[13]Bao X F，Duan J Y，F(xiàn)ang X，et al.Chemical modifications of the（1→3）-alpha-D-glucan from spores of Ganoderma lucidum and investigation oftheirphysciochemicalpropertiesand immunological activity[J].Carbohydrate Research，2001，336：127-140.

[14]Yang B，Jiang Y M，Zhao M M，et al.Structural characterisation of polysaccharides purified from longan（Dimocarpus longan Lour.） fruit pericarp[J].Food Chemistry，2009，115：609-614.

[15]Zhang A Q，Xiao N N，Deng Y L，et al.Purification and structural investigation of a water-soluble polysaccharide from Flammulina velutipes[J].Carbohydrate Polymers，2012，87：2279-2283.

[16]Kondakova A N，F(xiàn)udala R，Senchenkova S N，et al.Structure of a lactic acid ether-containing and glycerol phosphate-containing O-polysaccharide from Proteus mirabilis O40[J].Carbohydrate Research，2005，340：1612-1617.

[17]Fan J M，Zhang J S，Tang Q J，et al.Structural elucidation of a neutral fucogalactan from the mycelium of Coprinus comatus [J].Carbohydrate Research，2006，341：1130-1134.

[18]Bao X F， Liu C P， Fang J N， et al.Structural and immunological studies of a major polysaccharide from spores of Ganoderma lucidum（Fr.） Karst[J].Carbohydrate Research ，2001，332：67-74.

[19]Kocharova N A，Ovchinnikova O G，Toukach F V，et al.The O-polysaccharide from the lipopolysaccharide of Providencia stuartii O44 contains L-quinovose，a 6-deoxy sugar rarely occurring in bacterial polysaccharides[J].Carbohydrate Research，2005，340：1419-1423.

[20]楊開，薛介豐，金月忠，等.松木層孔菌多糖的微波提取和體外活性研究[J].食藥用菌，2013，21（2）：102-107.

[21]Chen H X，Zhang M，Qu Z S，et al.Antioxidant activities of different fractions of polysaccharide conjugates from green tea（Camellia Sinensis）[J].Food Chemistry，2008，106：559-563.

[22]Huang S Q，Ding S D，F(xiàn)an L P.Antioxidant activities of five polysaccharides from Inonotus obliquus[J].International Journal of Biological Macromolecules，2012，50：183-1187.

[23]Ma L S，Chen H X，Zhang Y，et al.Chemical modification and antioxidant activities of polysaccharide from mushroom Inonotus obliquus[J].Carbohydrate Polymers，2012，89（2）：371-378.

[24]Zhang Y L，Zhang J B，Mo X Y，et al.Modification，characterization and structure-anticoagulant activity relationships of persimmon polysaccharides[J].Carbohydrate Polymers，2010，82（2）：515-520.

Study on isolation，structural characterization and antioxidant activity evaluation of polysaccharide PP60-S1 from Phellinus pini

YANG Kai1，2，JIN Yue-zhong1，XING Chen1，HU Jiang-ning2，WANG Ru-wei2，SUN Pei-long1，*
（1.Department of Food Science and Technology，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China；2.Zhejiang Chinese Traditional Medicine and Natural Drug Research Institute，Hangzhou 310052，China）

The homogeneous polysaccharide PP60-S1 was obtained by water extraction ，ethanol precipitation and purified by DEAE-Sepharose F.F.and Sephacryl S-300 from the fruiting bodies of Phellinus pini.The polysaccharide PP60-S1 was composed of glucose，mannose and galactose with a molar ratio of 9.24∶1.00∶0.76，with an average molecular weight of 3.56 ×104u.The results of methylation analysis indicated that six kinds of glycosidic linkages were detected in the structure of PP60-S1：1-Glc、1，3-Glc、1，6-Glc、1，3-Gal、1，6-Gal、1，3，6-Man，respectively.The main chain contained mainly 1，6-Glc.Otherwise，the polysaccharide PP60-S1 exhibited a certain degree of antioxidant activity ，evaluated by in vitro assay of DPPH·， ABTS+· and ferricreducing antioxidant power（FRAP）.

Phellinus pini；polysaccharide；purification；structural characterization；antioxidant activity

TS201.2

A

1002-0306（2014）20-0076-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.008

2014－02－24

楊開（1978-），男，博士，副研究員，研究方向：生物活性物質提取分離與結構表征。

* 通訊作者：孫培龍（1964-），男，博士，教授，博士生導師，研究方向：食品化學與資源利用。

浙江省自然科學基金資助項目（LY13C200011）；國家科技支撐計劃資助項目（2013BAD16B07）。