SD大鼠3種慢性心力衰竭模型的建立及心功能比較

鐘澤 羅秀英 劉桂林 許朝陽

●論著

SD大鼠3種慢性心力衰竭模型的建立及心功能比較

鐘澤 羅秀英 劉桂林 許朝陽

目的評價制備3種慢性心力衰竭模型過程中大鼠心臟變化特點。方法90只SD大鼠分為4組，A組（n=20）尾靜脈注射阿霉素法，B組（n=20）結(jié)扎腹主動脈，C組（n=20）甲狀腺素灌胃。造模前后不同時間行超聲心動圖、腦利鈉肽（BNP）及心肌組織學檢查，并與相應(yīng)對照組（n=30）比較。結(jié)果A組大鼠造模后4周左心擴大、LVEF水平下降、血漿BNP水平開始升高，8～12周逐漸出現(xiàn)心室壁變?。籅組大鼠造模后4周出現(xiàn)心肌增厚、LVEF增高，8～12周出現(xiàn)左心擴大、LVEF水平下降、血漿BNP水平開始升高；C組大鼠造模后4周出現(xiàn)心肌增厚，LVEF無明顯改變,8～12周出現(xiàn)左心擴大、LVEF水平下降，血漿BNP水平升高；20周后3組大鼠均出現(xiàn)全心擴大、LVFS及LVEF明顯下降、血漿BNP水平明顯升高，3組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論應(yīng)用超聲心動圖、BNP檢測及心肌組織學檢測方法可有效評價3種大鼠慢性心力衰竭模型不同時期的心臟形態(tài)、功能及心肌組織變化。

慢性心力衰竭；阿霉素；腹主動脈縮窄；甲狀腺素；超聲心動圖

充血性心力衰竭是擴張型心肌病、冠心病、風濕性心臟病、高血壓心臟病等多種心血管疾病發(fā)展的終末階段，對人類生命構(gòu)成巨大威脅，已成為全球范圍內(nèi)造成死亡的主要原因[1]。隨著對心力衰竭發(fā)病機制研究的不斷深入，大量研究證實各種致心力衰竭因素發(fā)生后，心臟均經(jīng)歷一個心肌重塑、心功能代償及心功能失代償?shù)难葑冞^程[2]，本研究通過超聲心動描記術(shù)指標、檢測B型尿鈉肽（BNP）及心肌病理檢測等方法評價阿霉素法、腹主動脈縮窄法及甲狀腺素法制備大鼠慢性心力衰竭模型過程中心臟形態(tài)、功能及心肌細胞變化，探討這些檢測方法在復(fù)制各種類型心力衰竭模型中的應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 實驗動物90只清潔級雄性SD大鼠由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，體重（250±50）g，普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)20d。90只成年雄性SD大鼠采用隨機數(shù)字表法分為4組：A組（n=20）采用尾靜脈注射阿霉素法復(fù)制擴張型心肌病模型；B組（n=20）采用結(jié)扎腹主動脈法復(fù)制高血壓心臟病模型；C組（n=20）采用甲狀腺素灌胃法復(fù)制甲狀腺功能亢進性心臟病模型；對照組30只，每亞組10只，分別作為A組、B組和C組模型的對照組（A1亞組，B1亞組，C1亞組）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠慢性心力衰竭模型制備根據(jù)文獻[3-7]及預(yù)實驗結(jié)果，制備3組慢性心力衰竭的模型。（1）A組大鼠尾靜脈注射阿霉素1 mg/kg，2次/周，共6周，累積劑量達12 mg/kg。A1亞組大鼠尾靜脈注射等容積0.9%的氯化鈉溶液，周期同前作為對照。（2）B組大鼠按0.8 mg/kg的劑量，腹腔注射30g/L水合氯醛進行麻醉。麻醉后大鼠經(jīng)腹前正中縱向切口約2 cm，鈍性分離暴露腹主動脈，以直徑1.7mm探針與腹主動脈一起結(jié)扎，抽出探針后形成腹主動脈狹窄（約50%狹窄），腹腔一次性注射10萬U青霉素后關(guān)腹縫合。B1亞組分離腹主動脈后只穿線不結(jié)扎作為對照。（3）C組大鼠將左甲狀腺素鈉溶于生理鹽水中灌胃，按每100g大鼠體重給予60μg/d計算所需量，實驗過程中每周稱體重1次，根據(jù)體重改變所需劑量。C1亞組給予等量生理鹽水為對照組。

1.2.2 超聲心動描記術(shù)檢查于造模后4周、8～12周、20周對所有大鼠分別行超聲心動描記術(shù)檢查。采用5mg/kg地西泮和50 mg/kg氯胺酮混合腹腔注射麻醉大鼠。左前胸剪毛，大鼠仰臥位固定，使用GEVivid7心臟超聲診斷儀（10S探頭、圖像深度2.0～4.0cm、頻率10.0 MHz）進行檢查。以M型超聲心動圖連續(xù)測量3個不同心動周期左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）及舒張末期內(nèi)徑（LVEDd），取平均值，并按照Teichholtz公式計算左心室射血分數(shù)（LVEF）及左心室短軸縮短率（LVFS）。

1.2.3 血漿BNP測定于造模前及造模4、8、12、16、20周，各組大鼠眼眶取抗凝血1.0 ml，3 000 r/ min 4℃離心5 min取上清，存于-80℃冰箱待檢。采用ELISA法（BNP檢測試劑盒，上海源葉生物有限公司）定量測定血漿中BNP水平，具體操作按照試劑盒說明書。

1.2.4 Billingham半定量評估心肌病變造模20周后，各組大鼠脫頸椎法處死。取心尖部心肌組織用10%福爾馬林液固定，經(jīng)石蠟包埋、切片、HE染色后用光學顯微鏡觀察組織病變。Billingham半定量分級標準：觀察的心肌細胞中有空泡和（或）肌纖維缺失心肌細胞所占百分率判斷心肌病變程度[6]：（1）0分：無細胞病變；（2）1分：5%細胞病變；（3）1.5分：6%～15%細胞病變；（4）2分：16%～25%細胞病變；（5）2.5分：26%～35%細胞病變；（6）3分：36%以上細胞病變。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SAS10.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗，3組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 大鼠造模一般情況與死亡率3種方法干預(yù)后，大鼠陸續(xù)出現(xiàn)精神萎靡、進食減少、脫毛、體重增長緩慢或下降、活動量下降、口唇及足趾發(fā)紺等慢性心力衰竭的癥狀和體征。其中A組大鼠死亡2只（6.7%），B組死亡3只（10%），C組無死亡。55只大鼠（A組18只，B組17只，C組20只）出現(xiàn)心室擴大、室壁厚度增加、LVEDd和LVESd升高、LVEF和LVFS明顯降低，提示有左心室收縮功能障礙，血BNP明顯升高，表明慢性心力衰竭造模成功。對照組大鼠生長狀態(tài)均良好，飲食及活動、超聲心動描記術(shù)及血清BNP水平均未見明顯異常。

2.2 造模后4周、8～12周、20周超聲心動描記術(shù)檢測結(jié)果及比較見表1～3。

由表1～3可見，A組大鼠造模后4周左心擴大、LVEF下降，8～12周逐漸出現(xiàn)心室壁變薄，20周出現(xiàn)全心擴大、LVFS及LVEF明顯下降，與對照組

比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；B組大鼠造模后4周出現(xiàn)心肌增厚、LVEF升高，8～12周出現(xiàn)左心擴大、LVEF下降，20周出現(xiàn)全心擴大、LVFS及LVEF明顯下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；C組大鼠造模后4周出現(xiàn)心肌增厚，LVEF無明顯改變，8～12周出現(xiàn)左心擴大、LVEF下降，20周出現(xiàn)全心擴大、LVFS及LVEF明顯下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；20周后3組大鼠均出現(xiàn)全心擴大，LVFS、LVEF水平下降，3組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 血漿BNP水平測定結(jié)果及比較見表4。

由表4可見，造模后4周3組大鼠血漿BNP水平均開始升高，其后隨著心功能改變，血漿BNP水平逐漸升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），造模后20周3組大鼠血漿BNP水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.4 病理學檢查結(jié)果及比較造模后20周大鼠心肌細胞排列紊亂，心肌細胞肥大，胞漿淡染，細胞核明顯增大松散，細胞混濁腫脹，心肌間結(jié)締組織增生，心肌纖維有斷裂現(xiàn)象，分支增多，間隙增寬，間質(zhì)中血管壁增厚，中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，間質(zhì)充血。對照組大鼠心肌纖維排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)清晰，細胞核染色質(zhì)均勻分布，核呈橢圓形，心肌細胞之間排列緊密，細胞核致密，大小形狀規(guī)則，間質(zhì)中血管壁細胞呈單層排列且規(guī)則（圖1）。A、B、C組20周后Billingham評分均為（2.5+0.5）分，較對照組（0分）差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討論

心力衰竭是指各種原因所致心輸出量不能滿足機體代謝需要、以循環(huán)障礙為主的綜合征[9]，是許多心血管疾病終末期的共同結(jié)局，也是≥60歲老年人最主要的死亡原因。目前每年約有300萬人患有慢性心力衰竭，預(yù)計到2016年65歲以上老年人慢性心力衰竭的發(fā)病人數(shù)將增加50%以上[10]。隨著患者不斷增多，迫切需要通過對心力衰竭的發(fā)病機制不斷的進行深入研究找到新的預(yù)防和治療方法，因而需要大量復(fù)制各種心力衰竭模型。

目前心力衰竭模型的制作方法主要有心肌缺血型、壓力負荷型、容量負荷型和心肌病變型等,本研究根據(jù)相關(guān)文獻及預(yù)實驗結(jié)果，采用阿霉素法、腹主動脈縮窄法及甲狀腺素法制備慢性心力衰竭模型，并定期檢測超聲心動描記術(shù)、BNP等變化，其結(jié)果提示：A組大鼠造模后4周左心擴大、LVEF下降、血漿BNP水平開始升高，8～12周逐漸出現(xiàn)心室壁變薄，20周出現(xiàn)全心擴大、LVFS及LVEF明顯下降、血漿BNP水平明顯升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義；B組大鼠造模后4周出現(xiàn)心肌增厚、LVEF增高，8～12周出現(xiàn)左心擴大、LVEF下降、血漿BNP水平開始升高，20周出現(xiàn)全心擴大、LVFS及LVEF明顯下降，血漿BNP水平明顯升高；C組大鼠造模后4周出現(xiàn)心肌增厚，LVEF無明顯改變，8～12周出現(xiàn)左心擴大、LVEF下降，血漿BNP水平升高，20周出現(xiàn)全心擴大、LVFS及LVEF明顯下降，血漿BNP水平明顯升高，20周后3組大鼠均出現(xiàn)全心擴大，3組間比較差異無統(tǒng)計學意義。提示無論采用哪種造模方法，最終均出現(xiàn)全心擴大，其超聲心動描記術(shù)、血漿BNP等差異無統(tǒng)計學意義，與人類擴張型心肌病、高血壓心臟病、甲亢性心臟病等病程相符合。20周后檢測大鼠心肌病理出現(xiàn)：心肌細胞排列紊亂，心肌細胞肥大，胞漿淡染，細胞核明顯增大松散，細胞濁腫，心肌間結(jié)締組織增生，心肌纖維有斷裂現(xiàn)象，分支增多，間隙增寬，間質(zhì)中血管壁增厚，中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，間質(zhì)充血等病理變化均與心臟病患者相似。

綜上所述，采用阿霉素法、腹主動脈縮窄法及甲狀腺素法制備慢性心力衰竭模型，能在較大程度上模擬心力衰竭患者的病理及生理變化過程，故可用于多種原因心力衰竭的發(fā)病機制、病理變化、生理改變及藥物干預(yù)等基礎(chǔ)及臨床研究。

[1]ChaveyWE,BlaumCS,BlrskeBE,et al.Guidelinefor management of heart failure caused by systolic dysfunction:Part Treatment[J].Am Fam Physician,2001,64（6）：1045-1054.

[2]Diez J,Fortuno M A,Ravassa S.Apoptosis in hypertensive heart disease[J].CurrOpinCardiol,1998,13：317-325.

[3]成忠煌,胡雪峰,彭敏,等.阿霉素誘導(dǎo)大鼠慢性心力衰竭模型給藥劑量和頻率的優(yōu)化[J].湖北中醫(yī)雜志,2011,33（4）：9-11.

[4]吳運香,張野,謝春林,等.SD大鼠阿霉素慢性心力衰竭模型的建立與評價[J].中國藥理學通報,2011,27（8）：1170-1173

[5]Massart P E,Donckier J,Kyselovic J,et al.Carvedilol and lacidipine prevent cardiac hypertrophy and endothelin-1 gene overexpression afteraorticbanding[J].Hypertension,1999,34（6）：1197-1198.

[6]XingX Q,Xu J,Lü X W,et al.Combination of simvastain and losartan attenuates left ventricular myocardial fibrosis after pressure overload stateinrats[J].ChinPharmacolBull,2009,25（10）：1376-1379.

[7]Fukuyama K,Ichiki T,Takeda K,et al.Down regulation of Vascular Angiotensin II Type 1 Receptor by Thyroid Hormone[J].Hypertension, 2003,41：598-603.

[8]薛凌,付明,羅建方,等.急癥高血糖對N端腦鈉肽原評價心功能的影響[J].中華急診醫(yī)學雜志,2013,22（2）：164-168.

[9]袁志敏,呂渠霞,劉運德.心力衰竭的現(xiàn)代觀點與診治進展[J].心血管病學進展,1994,15（3）：149-152.

[10]Kell D T.Our future society:a global challenge[J].Circulation, 1997,95：2459-2464.

Establishment and comparison of 3 chronic cardiac failure models of SD rats

ZHONG Ze,LUO Xiuying,LIU Guilin,et al.
Department of Cardiology,the First People's Hospital of Jiande,Hangzhou 311600,China

LUO Xiuying,E-mail:273123477@qq.com

ObjectiveTo investigate cardiac changes during the development of 3 rat heart failure models.Methods 90 SD rats were divided into four groups.Heart failure models were established by tailvein injection ofAdriamycin(group A, n=20),abdominalaorta deligation(group B,n=20)or gastric gavage ofthyroxine(group C,n=20).Echocardiography,brain natriuretic peptide(BNP)and myocardial histology were measured and compared with control group(n=30).ResultsIn group A,left ventricle enlarged,left ventricular ejection fraction(LVEF)decreased and plasma BNP began to rise at 4 weeks, the ventricular wallthinned during 8～12 weeks.Both in group B and C,the ventricular wallthickened at 4 week,left ventricle enlarged and LVEF decreased with BNP being increased during 8～12 weeks.LVEF increased in group B and was not changed in group C at 4 weeks.After 20 weeks,global cardiac enlargement developed,LVFS and LVEF decreased and BNP increased significantly in allthree groups with no significant difference among them.ConclusionEchocardiography, BNP and histological examination may be used to evaluate the changes of cardiac morphology,function and myocardial tissues at different periods during the development of3 different rat heart failure models.

Chronic cardiac failure;Adrinmycin;Abdominal aorta deligation;Thyroxine;Echocardiography

2014-02-11）

（本文編輯：楊麗）

建德市科技發(fā)展項目（2010G03）

311600浙江省建德市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科

羅秀英，E-mail：273123477@qq.com