少弱精癥動(dòng)物模型建立的研究進(jìn)展

張盼盼， 劉鳳霞 綜述 阿地力江·伊明 審校

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室， 烏魯木齊 830011)

人類生殖能力呈逐年下降趨勢(shì)，大約20%的育齡夫婦受到不育不孕的困擾，男性因素占到40%～60%，其中精子生成、成熟、輸運(yùn)異常是男性不育最常見的原因[1-2]。而且研究發(fā)現(xiàn)無精癥(Azoospermia)、弱精癥(Asthenospermia)和少弱精癥(Oligoasthenospermia)與不育高度相關(guān)[3]。

少精癥是指禁欲2～7 d精子密度<20×109/L。輕度少精癥：精子密度(10～20)×109/L；中度少精癥：精子密度5～10×109/L；重度少精癥：精子密度<5×109/L。弱精癥是指禁欲2～7 d具有快速向前運(yùn)動(dòng)的精子A級(jí)和緩慢向前運(yùn)動(dòng)的精子B級(jí)總和(A級(jí)+B級(jí))<50%或A級(jí)精子<25%；輕度弱精癥：A級(jí)+B級(jí)=30%～50%，或A級(jí)<25%；中度弱精癥：A級(jí)+B級(jí)=30%～50%，其中A級(jí)<10%；重度弱精癥：A級(jí)+B級(jí)<30%，其中A級(jí)為零。無精癥是指3次精液檢查均無精子[4-5]。少弱精癥發(fā)病原因主要包括遺傳因素、性激素和精子相關(guān)基因突變、先天性輸精管缺如、抗精子抗體、感染、內(nèi)分泌因素、疾病、鋅缺乏、環(huán)境、飲食和吸煙等。而且其機(jī)制復(fù)雜，主要涉及一氧化氮和超氧化物歧化酶、蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化和膜流動(dòng)性、離子通道、微量元素異常等，由于病因及機(jī)制的不確定性，治療方法也就多種多樣，療效各異，主要有特異性治療(內(nèi)分泌治療)、半特異性治療(感染性不育和免疫性不育)、非特異性治療(提高精子質(zhì)量和活力)、酶制劑、抗氧化藥物、手術(shù)治療、輔助生殖技術(shù)和基因治療等。隨著體外受精-胚胎移植或卵細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)單精子注射(ICSI)技術(shù)的發(fā)展，大多數(shù)少弱精癥患者都能得到緩解和治愈，滿足生育要求。但由于治療費(fèi)用高、耗時(shí)耗力，導(dǎo)致很多患者不愿意和不配合治療。因此，少弱精癥的發(fā)病機(jī)制還需進(jìn)一步深入地研究，闡明其發(fā)生發(fā)展規(guī)律，并開發(fā)研制出療效更好、使用更方便、價(jià)格更便宜并容易被大眾認(rèn)可和接受的防治方案。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是常用的研究對(duì)象，建立具有良好穩(wěn)定性、可靠性和科學(xué)性的少弱精癥動(dòng)物模型就顯得尤為重要。目前少弱精癥動(dòng)物模型的制作多采用大鼠，其次為小鼠，亦有選用家兔及食蟹猴的報(bào)道[6]。本文就建立少弱精癥動(dòng)物模型的研究進(jìn)展綜述如下。

1 奧硝唑(Ornidazole,ORN)法

奧硝唑是一種5-硝基咪唑類衍生物，是繼甲硝唑、替硝唑之后的第3代硝基咪唑類衍生物，臨床上多用于治療厭氧菌、陰道滴蟲、阿米巴原蟲等感染[7]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)主要用于預(yù)防各種厭氧菌感染和抑制雄性大鼠的生殖功能。研究發(fā)現(xiàn)，奧硝唑可以可逆性抑制大鼠附睪精子活力，導(dǎo)致雄性大鼠不育[8]。國內(nèi)相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用奧硝唑400 mg·kg-1·d-1灌胃3～4 w時(shí)，可導(dǎo)致大鼠在10～14 d不育，并可在停藥7 d后完全逆轉(zhuǎn)，該劑量能顯著降低精子活動(dòng)力，但對(duì)精子密度無顯著影響。應(yīng)用奧硝唑800 mg·kg-1·d-1劑量時(shí)，精子活動(dòng)力與精子密度顯著降低[9-10]。奧硝唑的作用部位可能是在附睪，一方面是通過增加細(xì)胞脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛，抑制附睪中的能量轉(zhuǎn)換酶或非蛋白類物質(zhì)，使精子細(xì)胞受損、活動(dòng)力降低；另一方面通過其分子中的硝基在無氧環(huán)境中還原成氨基或通過自由基的形成，與細(xì)胞成分相互作用，從而導(dǎo)致精子細(xì)胞受損[11]。

2 腺嘌呤(Adenine)法

腺嘌呤灌胃或放入飼料，大鼠出現(xiàn)中醫(yī)腎陽虛表現(xiàn)，且精子質(zhì)量、性激素水平及睪丸組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，這些改變與人類腎陽虛不育相似[12-13]。腺嘌呤可直接降低17β-羥基類固醇脫氫酶活性，導(dǎo)致睪酮合成減少,或者通過腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)影響睪丸血液循環(huán)而損害性腺，而且可引起雄性大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、Smads蛋白表達(dá)異常，抑制生精作用。腺嘌呤還能引起睪丸萎縮、精曲小管退行性變、各級(jí)精細(xì)胞退化變性和數(shù)量減少、精子減少或缺如，同時(shí)精曲小管之間的結(jié)締組織增多，間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少，且3β-羥基類固醇脫氫酶活性顯著降低(此酶可將雄烯二酮還原為睪酮)，導(dǎo)致血中睪酮含量降低。黃天倫等[14]報(bào)道腺嘌呤在體內(nèi)不僅可以通過黃嘌呤氧化酶(XOD)的作用生成2，8-二羥基腺嘌呤，也可通過XOD的作用生尿酸，產(chǎn)生高尿酸血癥。XOD反應(yīng)過程中產(chǎn)生大量氧自由基，引發(fā)精子膜上多聚不飽和脂肪酸發(fā)生脂類過氧化反應(yīng)，使膜上出現(xiàn)流動(dòng)性不同的多相區(qū)域，破壞精子細(xì)胞的脂質(zhì)酸分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致膜的流動(dòng)性、通透性改變，從而使精子數(shù)量減少、活力下降。葛爭(zhēng)艷等[15]用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液按25 mg/mL濃度配制腺嘌呤，按0.1 mL/kg體質(zhì)量連續(xù)灌胃大鼠20 d即可制備少弱精癥大鼠模型。

3 雷公藤多甙(GTW)法

雷公藤多甙是一種免疫抑制藥物，具有明顯的抑精作用。童建孫等[16]進(jìn)行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，雷公藤多甙灌服16 mg·kg-1·d-1，連續(xù)5 w后，精子密度及活率下降，畸形率增加，可損害睪丸組織，引起雄性動(dòng)物血清睪酮、雌二醇下降，對(duì)睪丸生精上皮損傷的嚴(yán)重程度與投藥劑量的大小和投藥時(shí)間的長(zhǎng)短成正比, 停藥后生育力可迅速恢復(fù)。雷公藤多甙對(duì)大鼠生殖系統(tǒng)的靶細(xì)胞主要是生精細(xì)胞，精子細(xì)胞和精子受累最早，精母細(xì)胞次之，精原細(xì)胞敏感性最低；其機(jī)制可能與其誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡相關(guān)，其能使睪丸內(nèi)Bax、Fas、FasL和Caspase-3表達(dá)增加[17-18]；雷公藤多甙也可直接作用于變態(tài)期精子細(xì)胞內(nèi)骨架系統(tǒng)的微管或縱形粗纖維以及肌動(dòng)蛋白，導(dǎo)致出現(xiàn)大量頭頸分離、斷端頸部彎曲、頭畸形及多尾畸形精子；妨礙了正常細(xì)胞的分裂過程，出現(xiàn)了核分裂而胞質(zhì)不分裂的病理現(xiàn)象，最終導(dǎo)致精子生成障礙[19]。

4 環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，CP)法

環(huán)磷酰胺是臨床上常用的抗腫瘤藥物和免疫抑制劑，應(yīng)用環(huán)磷酰胺聯(lián)合化療方案中，精原細(xì)胞發(fā)育障礙并導(dǎo)致患者少精癥、無精癥[20]，而且具有濃度依賴性[21]，作用甚至長(zhǎng)達(dá)0.5～10 a[22]。環(huán)磷酰胺生育毒性主要是對(duì)生精干細(xì)胞的破壞，其使精子細(xì)胞染色體易位、精母細(xì)胞DNA斷裂，誘導(dǎo)生殖細(xì)胞遺傳物突變或畸形[23]；通過激活p53及Fas/FasL等途徑誘導(dǎo)生殖細(xì)胞凋亡[24]；還能抑制A型精原細(xì)胞標(biāo)志物c-kit蛋白的表達(dá)，干擾A型精原細(xì)胞增殖分化功能[25]。灌胃給予CP 10 mg·kg-1·d-1，2 w后便可發(fā)現(xiàn)大鼠各級(jí)生精細(xì)胞數(shù)量顯著減少，精子數(shù)量減少，精子活動(dòng)能力下降[26]。

5 棉酚(Gossypol)法

乙酸棉酚50 mg/kg灌胃給藥，3 d給藥1次，連續(xù)5次，即可制備少弱精癥大鼠模型[27]。靳國春等[28]用20 mg/kg喂養(yǎng)大鼠3個(gè)月，發(fā)現(xiàn)大鼠精子數(shù)量及精子活動(dòng)率均顯著下降，睪酮水平降低?；蛎刻旖o予大鼠灌胃棉籽油6 mL/kg，連續(xù)14 d，大鼠精子密度、精子活動(dòng)顯著降低，血清LH及FSH明顯下降[29]。棉酚主要損傷變態(tài)期精子細(xì)胞和中后期精母細(xì)胞，線粒體對(duì)棉酚最為敏感，是損傷最明顯的靶細(xì)胞器之一[30]。雄鼠在攝用棉酚期間，先后發(fā)生精子活動(dòng)度下降、附睪尾精子淤積、精子線粒體膜結(jié)構(gòu)異?；騺G失、胞漿膜及尾部微管結(jié)構(gòu)損傷或丟失，繼以精子發(fā)生障礙，前列腺分泌枸櫞酸減少，睪丸及副性腺重量下降，睪丸三磷酸腺苷酶、絲氨酸脫氫酶、乳酸脫氫酶、果糖酶、葡萄糖1、6-二磷酸酶活性下降。睪丸及副性腺對(duì)Zn2+攝入明顯減少，以睪酮為底物的5α還原酶及3α羥類固醇脫氫酶活性顯著降低[31]。

6 中醫(yī)方法

中醫(yī)在幾千年前就把“恐”這一情志列入到了致病因素中。壓力、恐懼是當(dāng)前人類致病的一個(gè)重要的發(fā)病因素，對(duì)人體神經(jīng)、內(nèi)分泌等多個(gè)系統(tǒng)、多臟器都有一定的影響，因此也越來越引起人們的關(guān)注。根據(jù)“恐傷腎”原理，采用貓嚇母鼠的方法，制備子代先天腎虛模型[32]，將孕鼠直接置于貓籠之下，貓籠與鼠籠僅一網(wǎng)之隔，貓爪可觸及雌鼠，雌鼠驚恐不已，縮在角落，不吃不喝，每天上午、下午各恐嚇2 h，共14 d，至孕鼠分娩前1 d為止。每次恐嚇時(shí)給貓喂1～2只雄鼠或非實(shí)驗(yàn)鼠吃，以增加恐嚇的氣氛。子鼠睪丸HE染色發(fā)現(xiàn)，恐嚇組曲細(xì)精管中生精細(xì)胞層數(shù)4～5層，生精細(xì)胞排列不整齊，分布多少不均，睪丸間質(zhì)內(nèi)明顯水腫，并見多數(shù)生精細(xì)胞胞漿有空泡變性，在精曲小管管腔內(nèi)出現(xiàn)少量散在巨噬細(xì)胞，個(gè)別形成多核巨細(xì)胞，管腔內(nèi)精子生成明顯減少，且分布不均。根據(jù)“外傷及腎”的原理，張慶彝等[33]用皮膚燒傷法制備腎虛模型，將電鉻鐵加熱燒傷大鼠背部脊椎兩側(cè)皮膚約5 s，有效燒傷面積為1 cm×2 cm，每周燒傷3次，3 w后發(fā)現(xiàn)睪丸精曲小管生精上皮腐脫，精母細(xì)胞內(nèi)大量空泡形成，胞核輕度濃縮，成熟精子明顯減少，間質(zhì)疏松，間質(zhì)細(xì)胞胞漿濃縮。沈雁等[34]用老虎鉗夾斷小白鼠雙側(cè)股骨上端，造成人為骨折，而后每天扭折骨折處，以加重?fù)p傷，3 w后發(fā)現(xiàn)骨折組睪丸精曲小管上皮腐脫、結(jié)構(gòu)紊亂及腔內(nèi)成熟精子量減少明顯，生精上皮層次減少及變性，精母細(xì)胞空泡形成量多。

7 維吾爾醫(yī)方法

維吾爾醫(yī)學(xué)為祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要組成部分，其是以實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)為主體、以整體治療為特征的醫(yī)學(xué)體系，具有良好的臨床療效和獨(dú)特的理論內(nèi)涵，在男科領(lǐng)域尤以療效顯著。近期阿地力江·伊明等[35-36]根據(jù)維醫(yī)體液質(zhì)論采取濕寒環(huán)境和濕寒飼料干預(yù)的方法成功建立了維醫(yī)異常黏液質(zhì)證候及陽痿病證大鼠模型，并發(fā)現(xiàn)證候及病證模型組大鼠睪丸組織中生精小管萎縮變形，管壁生精細(xì)胞數(shù)量明顯少于正常對(duì)照組，管壁厚，管徑小，基膜破損，生精上皮排列紊亂，生精細(xì)胞脫落、變性，間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其精子數(shù)量與活力顯著性降低，由此為從病因?qū)W角度建立少弱精癥動(dòng)物模型開辟了一條新的思路。

8 其他方法

岳廣平等[37]給成年大鼠每日肌注1次氫化可的松30 mg/kg，9 d后發(fā)現(xiàn)精子活動(dòng)度下降，其機(jī)制可能是抑制垂體前葉促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)釋放，使腎上腺皮質(zhì)分泌類固醇激素減少。Li等[38]用43℃水浴局部溫浴食蟹猴睪丸，發(fā)現(xiàn)可通過誘發(fā)生精子細(xì)胞凋亡導(dǎo)致精子數(shù)下降。另有關(guān)研究報(bào)道用4 mg/mL白消安，每只小鼠按40 mg/kg行腹腔內(nèi)單次注射，也可制作少弱精癥模型[39]。

綜上所述，動(dòng)物模型作為少弱精癥發(fā)病機(jī)制和防治研究的基礎(chǔ)，在少弱精癥研究領(lǐng)域具有舉足輕重的作用。每種模型的制備方法和機(jī)理都有所不同，而且存在著諸多局限，但在以往的研究中，動(dòng)物模型仍然為少弱精癥研究提供了大量有意義的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)?？梢愿鶕?jù)研究目的來選擇不同少弱精癥模動(dòng)物型，而且在此基礎(chǔ)上不斷改進(jìn)。因此，了解常用動(dòng)物模型的特點(diǎn)，建立新的更有效的少弱精癥動(dòng)物模型是今后生殖醫(yī)學(xué)工作者和該領(lǐng)域研究人員努力的方向之一。

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