1，25—（OH）2—D3對進(jìn)展性腎炎大鼠腎小管間質(zhì)膠原蛋白Ⅲ表達(dá)的影響

林建明等

[摘要] 目的 探討1，25-（OH）2-D3對進(jìn)展性腎炎大鼠腎小管間質(zhì)膠原蛋白Ⅲ（ColⅢ）表達(dá)的影響。 方法 將實驗動物按隨機數(shù)字表法分為3組（n=7）：假手術(shù)組（對照組）、進(jìn)展性腎炎組（模型組）、6 ng/（100 g·d） 1，25-（OH）2-D3干預(yù)組（治療組）。除對照組外，其余組均采用右腎切除并2次注射IgG（OX-7）鼠抗人Thy1.1單克隆抗體，制備進(jìn)展性腎炎大鼠模型。1，25-（OH）2-D3干預(yù)8周后，檢測各組大鼠24 h尿蛋白、血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）及電解質(zhì)的變化，Masson染色觀察腎組織病理改變。免疫組織化學(xué)檢測腎小管間質(zhì)ColⅢ的表達(dá)。 結(jié)果 與模型組比較，1，25-（OH）2-D3治療不僅使大鼠24 h尿蛋白及BUN均明顯降低（P<0.05），還能使ColⅢ表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05）。腎組織病理損害明顯減輕。 結(jié)論 1，25-（OH）2-D3可能通過明顯降低進(jìn)展性腎炎大鼠腎小管間質(zhì)ColⅢ的表達(dá)，減輕腎小管間質(zhì)纖維化而發(fā)揮腎臟保護作用。

[關(guān)鍵詞] 1，25-（OH）2-D3；ColⅢ；進(jìn)展性腎炎；腎小管間質(zhì)纖維化；大鼠

[中圖分類號] R692.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）02（a）-0004-04

腎小管間質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積容易引起腎功能不全，常見于許多慢性腎臟疾病。間質(zhì)膠原，尤其是Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原，通常作為腎組織基底膜的“腳手架”而普遍存在于腎臟中[1-2]。膠原及其相關(guān)分子在腎小管間質(zhì)的積聚即可以定義為腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）。腎小管間質(zhì)纖維化的病變程度嚴(yán)重影響了腎功能的正常運作。延緩或阻止腎小管間質(zhì)纖維化的進(jìn)展，可以預(yù)防慢性腎臟病的發(fā)生[3]。1，25-（OH）2-D3除調(diào)節(jié)鈣磷代謝外，在調(diào)節(jié)各種生物過程（如免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖和分化、抗纖維化、減少尿蛋白）中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[4]。但是，1，25-（OH）2-D3對進(jìn)展性腎炎腎小管間質(zhì)纖維化的保護作用尚不完全清楚。本研究旨在探討1，25-（OH）2-D3對進(jìn)展性腎炎大鼠模型中RIF膠原蛋白Ⅲ（ColⅢ）表達(dá)的影響，并觀察腎臟組織病理形態(tài)學(xué)的改變，便于進(jìn)一步了解1，25-（OH）2-D3對進(jìn)展性腎炎大鼠RIF的可能作用途徑及影響機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1，25-（OH）2-D3購自美國Sigma公司，IgG（OX-7）鼠抗人Thy1.1單克隆抗體購于美國Neo Markers公司，大鼠ColⅢ免疫組織化學(xué)試劑盒購于武漢BOSTER生物工程有限公司。

1.2 儀器

全自動多功能生化分析儀（日本Hitachi公司）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 動物模型制備及分組

雄性SD大鼠（重慶騰鑫生物技術(shù)公司提供，二級）21只，體重（131.2±10.0） g。將21只大鼠按隨機數(shù)字表法分為3組（n=7）：假手術(shù)組（對照組，只做腎包膜剝離，不予腎臟切除）、進(jìn)展性腎炎組（模型組）、6 ng/（100 g·d） 1，25-（OH）2-D3干預(yù)組（治療組），選用進(jìn)展性腎炎模型參照參考文獻(xiàn)[4]，行右腎摘除術(shù)，分別于術(shù)后第1、2周予尾靜脈注射IgG（OX-7）鼠抗人Thy1.1單克隆抗體1.2 mg/（kg·d），共2次。1，25-（OH）2-D3干預(yù)組于術(shù)后予1，25-（OH）2-D3 6 ng/（100 g·d）入飲水中灌胃至8周。所有大鼠均于8周后處死，收集24 h尿液，取大鼠心臟血并制作腎組織標(biāo)本。

1.4 觀察指標(biāo)與方法

1.4.1 24 h尿蛋白定量 處死大鼠前3 d，將大鼠放入代謝籠中收集24 h尿液，每只收集3次，用雙縮脲法測定尿蛋白含量，求平均尿蛋白含量。

1.4.2 血生化檢測 取大鼠心臟血清，測定血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）、鈣、磷等。

1.4.3 腎臟組織病理學(xué)檢查 腎組織以10%甲醛固定并編號，石蠟包被，2 μm厚連續(xù)切片，Masson染色，光鏡下觀察腎臟病理改變。細(xì)胞核染黑藍(lán)色，膠原纖維呈綠色，肌纖維、紅細(xì)胞呈紅色。

1.4.4 免疫組織化學(xué)法檢測 ColⅢ蛋白的表達(dá)：取2 μm厚石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，滅活內(nèi)原性酶，熱修復(fù)抗原，抗原抗體反應(yīng)，DAB顯色、脫水、透明、封片、顯微鏡觀察。操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。陽性產(chǎn)物呈深褐色，不加抗體為陰性對照。

1.4.5 免疫組織化學(xué)分析 采用顯微圖像分析系統(tǒng)（Olympus C3040-ADU）對各組染色結(jié)果進(jìn)行積分光密度值（integral optical density，IOD）測定，每張切片隨機選取10個高倍視野，每個視野代表0.13 mm2的區(qū)域面積，計算其IOD值，取平均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，經(jīng)方差齊性檢驗，再進(jìn)行兩獨立樣本均數(shù)t檢驗和組內(nèi)的方差分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 1，25-（OH）2-D3對進(jìn)展性腎炎大鼠24 h尿蛋白、腎功能的影響

術(shù)后8周，模型組24 h尿蛋白量、SCr和BUN均顯著高于對照組（P<0.05）。經(jīng)1，25-（OH）2-D3干預(yù)治療后，與模型組比較，24 h尿蛋白量、BUN均顯著降低（P<0.05），兩組間SCr差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。治療前后電解質(zhì)鈣、磷水平在治療組無明顯變化（P>0.05）（表1）。

表1 3組大鼠各項檢測指標(biāo)的比較（x±s）

與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.2 1，25-（OH）2-D3對腎組織病理變化的影響

Masson染色（圖1）顯示，對照組腎小管間質(zhì)形態(tài)基本正常；模型組見腎小管上皮細(xì)胞萎縮、脫落，腎小管管腔擴張、間質(zhì)膠原纖維增厚。與對照組比較，模型組間質(zhì)炎癥和纖維化進(jìn)行性加重。與模型組比較，治療組腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)正常，間質(zhì)炎癥得到改善，膠原纖維積聚減少。

2.3 1，25-（OH）2-D3對進(jìn)展性腎炎大鼠腎間質(zhì)ColⅢ蛋白表達(dá)的影響

ColⅢ蛋白表達(dá)主要集中于腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)，模型組腎間質(zhì)ColⅢ蛋白表達(dá)較對照組顯著增多（P<0.01），應(yīng)用1，25-（OH）2-D3治療后，ColⅢ表達(dá)均較模型組明顯減少（P<0.05）（圖2）。

3 討論

腎臟纖維化是一個常見的導(dǎo)致腎臟功能衰竭的終末事件。因此，了解腎臟纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程對腎臟疾病的早期干預(yù)治療有重大意義。近年來研究證實，一種活性維生素D3類似物——帕立骨化三醇可以減緩單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠模型中間質(zhì)纖維化、抑制腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[5]、改善腎臟炎癥[6-7]，減少尿蛋白，抑制足細(xì)胞損傷[8]。因而，本研究觀察了進(jìn)展性腎炎1，25-（OH）2-D3通過抑制RIF ColⅢ的表達(dá)，發(fā)揮進(jìn)展性腎炎抗纖維化的保護作用。

本研究中，Masson染色結(jié)果顯示，模型組腎小管上皮細(xì)胞萎縮、脫落，腎小管管腔擴張、間質(zhì)膠原纖維增厚，與對照組比較，模型組間質(zhì)炎癥和纖維化進(jìn)行性加重，證實系膜增生性腎炎模型大鼠是目前觀察進(jìn)展性腎炎比較理想的動物模型[9-10]。生化指標(biāo)顯示，模型組24 h尿蛋白含量、SCr、BUN均較對照組明顯升高，表明進(jìn)展性腎炎的大鼠模型造模成功。在予以1，25-（OH）2-D3干預(yù)治療后發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，24 h尿蛋白含量及BUN均降低，提示1，25-（OH）2-D3可以減少進(jìn)展性腎炎大鼠模型中的尿蛋白含量、抑制腎臟纖維化，提高腎臟功能。另外，本實驗還監(jiān)測了血電解質(zhì)鈣、磷的變化，發(fā)現(xiàn)在給予1，25-（OH）2-D3治療前后，鈣、磷無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，表明該1，25-（OH）2-D3的實驗濃度[11]不會引起鈣、磷代謝紊亂，從而干擾實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

ColⅢ是腎組織基底膜的重要組成成分，對維持基底膜的完整性發(fā)揮重要作用[12]。ColⅢ表達(dá)的過多或過少均提示腎組織基底膜的結(jié)構(gòu)及完整性發(fā)生了改變。在腎組織基底膜中，腎間質(zhì)基底膜占其總量的85%～90%[13]。本研究中亦發(fā)現(xiàn)進(jìn)展性腎炎大鼠模型腎間質(zhì)組織中ColⅢ表達(dá)較對照組明顯增加，而應(yīng)用1，25-（OH）2-D3干預(yù)后，ColⅢ表達(dá)明顯下降，進(jìn)一步提示了1，25-（OH）2-D3可能通過ColⅢ表達(dá)減少，減輕RIF的發(fā)生、發(fā)展。本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，進(jìn)展性腎炎大鼠模型腎間質(zhì)組織中結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）表達(dá)增加，該因子又是公認(rèn)的較強的促纖維化生長因子[14]，可促進(jìn)細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)，如ColⅢ[15]、纖連蛋白和整合素α5顯著增加[16]，提示1，25-（OH）2-D3降低ColⅢ的表達(dá)可能通過抑制腎小管間質(zhì)組織中CTGF的表達(dá)發(fā)揮作用。

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（收稿日期：2013-11-01 本文編輯：林利利）

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（收稿日期：2013-11-01 本文編輯：林利利）