S-KIR基因組合型與肝移植術(shù)后急性排斥發(fā)生率的關(guān)

陳小平，李雪松，駱利敏，陳世洪，王忠，羅敏，肖露露

自然殺傷(nature killer，NK)細(xì)胞表面的免疫蛋白樣多態(tài)性家族受體(killer immunoglobulin-like receptor，KIR)對(duì)其發(fā)揮細(xì)胞毒樣自然殺傷作用具有重要意義。KIR可調(diào)節(jié)NK細(xì)胞在感染反應(yīng)、腫瘤免疫、移植免疫和自身免疫性疾病中的殺傷功能，研究其多態(tài)性有助于理解NK細(xì)胞作為先天性免疫細(xì)胞發(fā)揮有益或有害免疫作用的機(jī)制[1-2]。近年有關(guān)KIR與腎移植和肝移植急性排斥反應(yīng)(acute rejection，AR)的研究主要集中在供受者NK細(xì)胞的KIR與人類主要組織相容性復(fù)合物Ⅰ(human leukocyte antigenⅠ，HLA-Ⅰ)類分子的錯(cuò)配分析[3-5]。這些錯(cuò)配分析表明，HLA-C是抑制型NK細(xì)胞受體(L-KIR)最主要的配體，調(diào)節(jié)HLA-C與KIR的相互作用可能是改善移植物及患者長期存活的重要途徑。但是，目前尚不明確KIR受體發(fā)揮的作用，因?yàn)橐粋€(gè)NK細(xì)胞可以單獨(dú)或同時(shí)表達(dá)多個(gè)抑制型和激活型KIR受體(S-KIR)，不同個(gè)體KIR基因的表達(dá)頻率和基因組合也不相同。本研究回顧性分析56對(duì)供受者KIR基因的組合型，觀察KIR基因是否與肝移植術(shù)后AR的發(fā)生相關(guān)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 解放軍458醫(yī)院肝膽外科2007年2月－2013年2月因肝衰竭接受原位異基因肝臟移植的受者56例及相應(yīng)供者。取靜脈血液2ml，EDTANa2抗凝，－20℃保存。

1.2 肝移植受者臨床信息采集 56例受者均為初次肝臟移植，年齡41.9±12.1(19～60)歲，其中男性52例(92.86%)，女性4例(7.14%)。原發(fā)疾病包括原發(fā)性肝癌、肝炎后肝硬化、酒精性肝硬化、肝豆?fàn)詈俗冃院喜⒓毙愿喂δ芩ソ?。肝臟移植后住院天數(shù)32.7±10.3d，移植物存活＞30d。肝移植術(shù)式均為經(jīng)典原位肝移植。

1.3 肝移植后AR的診斷 根據(jù)Banff排斥活動(dòng)指數(shù)明確是否發(fā)生AR以及AR的嚴(yán)重程度。診斷標(biāo)準(zhǔn)：①臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、尿量減少、移植肝區(qū)脹痛、血清轉(zhuǎn)氨酶升高伴或不伴膽紅素升高；②彩色多普勒超聲檢查顯示供肝血管阻力指數(shù)升高；③供肝細(xì)針穿刺活檢病理檢查符合AR病理標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 術(shù)中及術(shù)后免疫抑制劑的使用 所有受者術(shù)中無肝期前和無肝期均使用甲潑尼龍(Pred)500mg；術(shù)后基礎(chǔ)免疫抑制方案采用三聯(lián)療法[他克莫司(FK506)+霉酚酸酯(MMF)+Pred]，即術(shù)后第1～6天靜脈使用Pred并逐日遞減使用量，術(shù)后第7天開始改為口服，60mg/d，每3～4d遞減10mg，直至使用劑量為10mg/d時(shí)維持，術(shù)后第2天加用MMF，1g/次，2次/d，術(shù)后第5天加用FK506并維持藥物濃度(谷濃度)為8～10ng/ml。

1.5 KIR基因分型 取全血提取DNA，A260/A280為0.9～1.6。采用序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(polymerase chain reaction-sequences specific primer，PCR-SSP)進(jìn)行KIR基因分型。

1.5.1 KIR引物序列設(shè)計(jì)[1]根據(jù)2010年11月10日IPD (immuno polymorphism database)KIR序列數(shù)據(jù)庫(www.ebi.ac.uk/ipd/kir)公布的KIR堿基編碼序列(release 1.3.0)，設(shè)計(jì)23對(duì)上下游引物序列，經(jīng)BLAST軟件驗(yàn)證可識(shí)別16個(gè)KIR基因及12個(gè)等位基因，包括14個(gè)功能基因及其8個(gè)等位基因2DL1、2DL2、2DL3、2DL4(group1& group2)、2DL5(A*001、005、B*、B*002、003、004)、3DL1、3DL2、3DL3、2DS1、2DS2、2DS3、2DS4(group1& group2)、2DS5、3DS1，沉默基因2DP1、3DP1(*001、002、003、004)。內(nèi)對(duì)照采用人類生長激素(HGH)基因特異性引物，濃度25μmol/L。引物由天津秀鵬科技有限公司合成(表1)。

1.5.2 PCR-SSP反應(yīng) 反應(yīng)體系：模板DNA 1μl，PCR Buffer 5μl，15mol/L MgCl21μl，dNTP 1μl，上、下游引物各1μl(濃度為25μmol/L)，Taq酶0.08U。96℃預(yù)變性 2min；96℃變性15s，65℃退火60s，10次循環(huán)；96℃變性15s，61℃退火50s，30℃延伸30s，20次循環(huán)。依次取擴(kuò)增產(chǎn)物8μl，2%瓊脂糖凝膠水平電泳(12mV/cm)，溴化乙啶染色，UVP成像。

1.5.3 S-KIR組合類型與基因包含關(guān)系 參照文獻(xiàn)[2]，KIR基因組合型分為L-KIR(AA)和S-KIR(AB/BB類型)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析。兩組計(jì)量資料的比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，兩組AR發(fā)生率的比較采用Fisher確切概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 受者KIR基因頻率及組合型頻率 由于沉默基因2DP1、3DP1會(huì)導(dǎo)致內(nèi)在遺傳缺失而無法闡述其功能，本研究參照文獻(xiàn)[2]對(duì)KIR功能基因的14個(gè)組合型進(jìn)行了分析。56例受者共獲得8個(gè)組合型，其中2個(gè)KIR基因的組合型為：由多個(gè)抑制型KIR基因(KIR-2DL1、2DL3、2DL4、3DL1、3DL2、3DL3)和1個(gè)激活型KIR基因(2DS4)組成，即僅包含AA類型；由多個(gè)抑制型KIR基因(KIR-2DL1、2DL3、2DL4、3DL1、3DL2、3DL3)和多個(gè)激活型KIR基因(2DS1、2DS2、2DS3、2SD4、2DS5、3DS1)組成，即AB類型；由多個(gè)抑制型KIR基因(KIR-2DL1、2DL3、2DL4、3DL1、3DL2、3DL3)和不包括KIR-2DS4的多個(gè)激活型KIR(2DS1、2DS2、2DS3、2DS5、3DS1)組成，即BB類型(表2)。其中L-KIR(AA)在肝移植患者中的表達(dá)頻率為0.499，S-KIR(AB/BB)在肝移植患者中的表達(dá)頻率為0.500(表3)。

2.2 肝移植后受者AR發(fā)生率 56例受者中有16例發(fā)生了AR，AR發(fā)生率28.6%，AR發(fā)生時(shí)間為術(shù)后7～30d，中位時(shí)間為術(shù)后14d。

表1 KIR基因及其等位基因引物序列Tab.1Primers for identification of KIR genes and allelic genes

表2 KIR基因組合與KIR基因的包含關(guān)系Tab.2KIR genotype assortment and inclusion relation thereof

表356 例肝移植受者KIR基因頻率和組合型頻率一覽表Tab.3Frequency of KIR gene and its assortment in 56cases of liver transplantation recipients

2.3 供、受者KIR基因組合型與肝移植后AR的關(guān)系 16例術(shù)后發(fā)生AR的患者中，受者為L-KIR者占18.8%(3/16)，受者為S-KIR者占43.8%(7/16)，兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；供者為L-KIR者占25.0%(4/16)，供者為S-KIR者占12.5%(2/16)，兩者之間差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.4受者KIR激活基因數(shù)量與肝移植后AR發(fā)生率的關(guān)系 在移植后發(fā)生AR的受者中，表達(dá)1個(gè)KIR激活基因(S1)的占16.67%，表達(dá)≥2個(gè)激活KIR基因(S2)的占83.33%，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討 論

器官移植后，聯(lián)合應(yīng)用免疫抑制藥物可在細(xì)胞周期的不同階段和不同信號(hào)傳導(dǎo)通路上阻斷淋巴細(xì)胞的活化、增殖[6-7]。NK細(xì)胞具有自然殺傷作用，可以通過加強(qiáng)免疫抑制作用來控制宿主對(duì)移植物的排斥。此外，KIR還可特異性識(shí)別HLA，形成對(duì)靶細(xì)胞的激活或耐受通路，介導(dǎo)并調(diào)節(jié)NK細(xì)胞和效應(yīng)性T細(xì)胞的殺傷功能。NK細(xì)胞毒性被認(rèn)為是特定的KIR的刺激性效應(yīng)和抑制性效應(yīng)之間平衡的結(jié)果。由此可以認(rèn)為，在病理和藥物環(huán)境下，NK細(xì)胞承擔(dān)著“獲得免疫”的生物學(xué)功能[5]。本研究結(jié)果顯示，L-KIR(AA)在肝移植患者中占50.0%(28/56)，其表達(dá)頻率為0.499，S-KIR(AB/BB)也占50.0%(28/56)，其表達(dá)頻率為0.500。國內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為在肝移植患者中，KIR基因組合型以抑制性信號(hào)通路為主[4-5]，但本文結(jié)果顯示S-KIR在其中也起著重要作用。

本研究對(duì)L-KIR/S-KIR與移植后AR的關(guān)系進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，L-KIR受者AR發(fā)生率較低但供者AR發(fā)生率較高，S-KIR受者AR發(fā)生率較高但供者AR發(fā)生率較低。此外，本研究結(jié)果還顯示，供受者基因組合型為L-KIR或S-KIR時(shí)，其AR發(fā)生率之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，即無論KIR組合型為抑制型還是激活型，對(duì)肝移植后AR的發(fā)生均沒有明顯影響。進(jìn)一步分析顯示，受者S-KIR數(shù)目≥2與移植后AR的發(fā)生有關(guān)，即受者S-KIR數(shù)目≥2有增加肝臟移植后AR發(fā)生率的可能性，提示在肝移植中對(duì)受者進(jìn)行KIR檢測(cè)具有一定臨床意義。

本組研究對(duì)象中有部分肝癌患者，而肝癌細(xì)胞能明顯下調(diào)KIR表達(dá)，抑制NK細(xì)胞活性，也可能并未直接參與對(duì)移植物的排斥，而是通過一些未知的免疫信號(hào)通路對(duì)受者獲得性免疫功能的調(diào)節(jié)起作用[8]?？傊?，我們的研究提示，受者S-KIR基因組合型及數(shù)目可能增加肝移植術(shù)后AR的發(fā)生率，可借助S-KIR或L-KIR與特異性識(shí)別配體HLA-Ⅰ類分子來調(diào)控受者的NK細(xì)胞功能。上述結(jié)論為肝移植后小劑量、低濃度、聯(lián)合抗排斥藥物的臨床應(yīng)用研究提供了參考。

[1]Eissens DN, Van Der Meer A, Van Cranenbroek B, et al.Rapamycin and MPA, but not CsA, impair human NK cell cytotoxicity due to differential effects on NK cell phenotype[J].Am J Transplant, 2010, 10(9): 1981-1990.

[2]Moroso V, van der Meer A, Tilanus HW, et al. Donor and recipient HLA/KIR genotypes do not predict liver transplantation outcome[J]. Transpl Int, 2011, 24(9): 932-942.

[3]Castroagudín JF, Molina E, Varo E. Calcineurin inhibitors in liver transplantation: to be or not to be[J]. Transplant Proc, 2011,43(6): 2220-2223.

[4]Fu SJ, Yu LX, Luo M, et al. Association between inhibitory KIR genotype assortment and acute rejection after kidney transplantation[J]. J Fourth Mil Med Univ, 2009, 30( 10): 929-931. [付紹杰, 于立新, 羅敏, 等. 抑制型KIR基因組合型與腎移植急性排斥反應(yīng)的關(guān)系[J]. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2009,30(10): 929-931.]

[5]Yu LX, Xiao F, Xiao LL, et al. KIR/HLA ligand matching and acute rejection after kidney transplantation[J]. J South Med Univ, 2010, 30(2): 288-291. [于立新, 肖飛, 肖露露, 等. KIR及其HLA配體與腎移植急性排斥反應(yīng)的關(guān)系[J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 30(2): 288-291.]

[6]Yu HB, Jian M, Liu Y, et al. Expression of ILT-4mRNA in peripheral blood mononuclear cell of liver cancer patients[J].J Logist Univ CAPF(Med Sci), 2012, 21(12): 955-957. [喻紅波, 簡明, 劉陽, 等. 肝癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞ILT-4mRNA的表達(dá)[J]. 武警后勤學(xué)院學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2012, 21(12): 955-957.]

[7]Li T, Hou J. Progress of acute graft versus host disease caused by natural killer T cells[J]. Chin J Pract Intern Med, 2013, 33(2):154-156. [李拓, 侯健. 自然殺傷樣T細(xì)胞引發(fā)急性移植物抗宿主病研究進(jìn)展[J]. 中國實(shí)用內(nèi)科雜志, 2013, 33(2): 154-156.]

[8]Kitchens WH, Uehara S, Chase CM, et al. The Changing role of natural killer cells in solid organ rejection and tolerance[J].Transplantation, 2006, 81(6): 811-817.