生物玻璃條索修復(fù)骨缺損的有效性研究

樊博，王臻，吳暢，劉冬，高鵬，肖鑫，張浩強，黃海

作為骨組織工程的重要組成部分，骨移植材料修復(fù)骨缺損的能力受到了眾多學者的關(guān)注，尤其是移植材料的生物相容性、成骨能力以及降解性能更是當前研究的重點和熱點[1-3]。大量研究顯示，生物活性玻璃45S5不僅具有良好的生物相容性、成骨能力和降解性能[4-7]，而且具有促進血管生成的能力[8-9]。β-磷酸三鈣(β-TCP)生物陶瓷修復(fù)骨缺損已有大量文獻報道[10-13]，具有良好的骨誘導、骨傳導能力及促血管化作用。膠原蛋白作為骨的重要組成部分，在止血、填充組織缺損以及作為組織工程支架促進組織愈合方面發(fā)揮著重要作用[14-17]。另有研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ型膠原蛋白對骨的礦化作用有著重要影響[18-20]。本研究擬將含有Ⅰ型膠原的新型生物活性骨移植材料植入兔股骨髁缺損處，并通過大體觀察、Lane-Sandhu X線評分及組織學染色分析其成骨能力和降解性能，旨在為其進一步應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年新西蘭大白兔18只，均為雌性，6～8月齡，體重2.5～3.5kg，平均2.85kg，購自西安迪樂普生物資源開發(fā)有限公司，許可證號SCXK(陜)2006-001。實驗過程中對動物的處置符合科技部2006年發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 實驗材料 膠原生物玻璃條索(No vaBon e collagen bioactive glass strips)由牛皮提取的高純度Ⅰ型膠原和直徑32～2500μm的45S5生物玻璃按1.5:8.5比例制作，為直徑0.5cm、高1.0cm的圓柱體。膠原生物玻璃顆粒(NovaBone co llagen bioactive g lass m o rsels)的組成成分和比例與膠原生物玻璃條索相同，但其形態(tài)為膠原纖維和玻璃顆?；旌系姆勰?。含Ⅰ型膠原的β-TCP顆粒由牛皮提取的高純度Ⅰ型膠原和顆粒大小多變的β-TCP顆粒按1:4比例制作，為大小不等的具有生物活性的顆粒。以上3種材料均由美國諾邦生物制品有限公司提供。

1.3 手術(shù)方法及分組 按缺損部位植入的材料不同，實驗分為3組，即A組(自體骨髓+膠原生物玻璃條索)、B組(自體骨髓+膠原生物玻璃顆粒)、C組(自體骨髓+含Ⅰ型膠原的β-TCP顆粒)，每組6只兔(12個股骨髁)。所有實驗動物均在術(shù)前24h禁水禁食，肌注陸眠寧Ⅱ(吉林省華牧動物保健品有限公司)0.5m l/kg進行麻醉，取兔股骨下端膝關(guān)節(jié)外側(cè)切口，逐層切開，直至暴露股骨外側(cè)髁。使用高速磨鉆(北京天和)在股骨髁松質(zhì)骨部建立直徑為6mm，深12mm的腔隙性骨缺損模型，紗布壓迫止血，并清理殘余骨碎屑。利用骨穿針在同側(cè)脛骨近端穿刺抽取骨髓液1.5～2.0m l，將抽取出的骨髓液與植入材料充分混合，立即植入骨缺損處，逐層關(guān)閉切口。術(shù)后雙側(cè)下肢不予固定，連續(xù)3d肌內(nèi)注射硫酸慶大霉素4萬U/d，定期觀察動物一般情況。按照實驗分組結(jié)果，術(shù)后6周和12周每組分別隨機處死3只動物，在骨缺損上方截取股骨髁，立即置于10%甲醛液中固定7d，用于后續(xù)檢測分析。

1.4 檢測指標

1.4.1 動物一般情況觀察 主要包括術(shù)后恢復(fù)情況，飲食以及二便情況，對外界刺激的反應(yīng)程度等。

1.4.2 大體觀察 術(shù)后6、12周取材時，觀察切口，評價愈合情況；觀察缺損周圍是否有炎性包塊，缺損部位是否愈合，以及是否有異常的骨破壞和畸形愈合；觀察膝關(guān)節(jié)內(nèi)有無炎性積液，有無材料漏出。

1.4.3 X線分析 術(shù)后6周和12周取到的股骨髁標本分別拍攝正、側(cè)位X線片，采用Lane-Sandhu X線評分標準[21]對側(cè)位照片進行成骨情況評分。

1.4.4 硬組織切片檢測 將在10%甲醛溶液中固定7d的標本取出，沿與股骨長軸平行方向均分為兩半，一半置于－20℃冰箱內(nèi)保存，另一半用于硬組織切片觀察。將標本置于梯度乙醇(70%、90%、100%)中進行脫水，隨后置于浸塑液Ⅰ、浸塑液Ⅱ、浸塑液Ⅲ中各10d，然后用聚丙烯酸甲酯(PMMA)包埋，SHANDON真空抽吸機抽吸6h后，置于50℃水浴鍋中加熱48h，直至PMMA凝固，取出包埋好的標本，使用Leica-SP 1600型硬組織鋸式旋轉(zhuǎn)切片機(Leica公司，德國)平行于標本的中切面進行切片，厚約180μm。將修剪好的切片粘貼于樹脂載玻片上，待其晾干后置于玻璃板下將切片壓平，隨后將切片置于RF-1型硬組織切片研磨機(西安瑞豐儀器設(shè)備有限責任公司)上用1500目砂紙進行磨片，直至切片厚度約70μm，再用齒科拋光打磨機(西安泛亞醫(yī)療器械有限責任公司)對切片進行拋光，直至光學顯微鏡下觀察不到劃痕。隨后將所有切片進行Van-Gieson(VG)染色，在全自動光學顯微鏡(Leica LA型，Leica公司，德國)下觀察骨缺損區(qū)成骨情況、材料降解情況以及是否有炎性細胞聚集等。應(yīng)用View finder Version 3.0.1(Pixera公司，美國)軟件觀察并采集照片，Im age-Pro Plus 6.0圖像分析軟件(Med ia Cybernetics公司，美國)計算切片中新生骨和剩余材料占骨缺損區(qū)域面積的百分比。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 所有動物術(shù)后恢復(fù)良好，無脫線及明顯感染現(xiàn)象；進食良好，二便無異常；對外界刺激反應(yīng)靈敏，活動正常，與未手術(shù)動物相比無明顯差別。

2.2 大體觀察 各組動物傷口愈合情況良好，未見紅腫、滲出及壞死現(xiàn)象，均為一期愈合。骨缺損周圍未見異常炎性纖維包塊，未發(fā)現(xiàn)額外的骨破壞以及畸形愈合。膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)無明顯積液，滑膜光滑平整，未發(fā)現(xiàn)漏出的材料顆粒。6周時肉眼尚可辨別缺損處材料與周圍骨組織的界線，12周時缺損處材料與周圍骨組織融合良好，肉眼難以區(qū)分其界線。

2.3 X線分析 從拍攝的X線片上可以觀察到6周時A組材料已經(jīng)部分吸收且伴有毛玻璃樣的新骨生成，新生骨與周圍骨組織分界線模糊，但是缺損區(qū)的材料密度與周圍骨組織仍不一致；B組材料也可觀察到少量吸收現(xiàn)象，材料邊界和內(nèi)部結(jié)構(gòu)不清晰，與A組相比，其材料與周圍骨組織密度差異更大；C組缺損部位材料無明顯降解吸收，材料清晰可見，與周圍骨組織的分界線清楚，成骨現(xiàn)象不明顯(圖1)。側(cè)位片Lane-Sandhu X線評分顯示，A組評分高于B組和C組(P<0.05)，且B組的評分高于C組(P<0.05，表1)。12周時，A組缺損區(qū)已經(jīng)基本無剩余材料，密度與周圍骨質(zhì)接近，可觀察到疑似骨髓腔部分再通現(xiàn)象；B組材料已經(jīng)大部分被吸收，轉(zhuǎn)而以新生骨替代，可見疑似骨髓腔部分重建現(xiàn)象；C組材料與周圍骨組織界線已經(jīng)模糊，內(nèi)部密度不均勻，與周圍骨質(zhì)有融合(圖1)。側(cè)位片Lane-Sandhu X線評分結(jié)果表明，A組評分高于B組和C組(P<0.05)，且B組評分高于C組(P<0.05)。與6周時比較，12周時3組評分均明顯增高(P<0.01，表1)。

圖1 3種材料植入后的6周和12周側(cè)位X線片F(xiàn)ig. 1 Lateral X-ray p ictu re of 6th and 12th w eek after insertion of the new b ioactive m aterialArrow s ind icate the areas of m ateria ls' insertion

表1 各組骨生成及重塑情況的Lane-Sandhu X線評分結(jié)果(±s，n=6)Tab. 1 Lane-Sandhu X-ray sco res of osteogenesis and rem ode ling in each g roup (±s, n=6)

表1 各組骨生成及重塑情況的Lane-Sandhu X線評分結(jié)果(±s，n=6)Tab. 1 Lane-Sandhu X-ray sco res of osteogenesis and rem ode ling in each g roup (±s, n=6)

(1)P<0.05 com pared with group A; (2)P<0.05 com pared with g roup B; (3)P<0.01 com pared with 6 w eeks

Tim e (w eek) Group A Group B Group C 6 5.0±1.0 3.5±1.0(1) 2.2±0.8(1)(2)12 8.2±1.2(3) 5.8±1.0(1)(3) 4.0±1.0(1)(2)(3)

2.4 組織學觀察結(jié)果 各組光學顯微鏡下觀察均未見明顯炎癥細胞聚集或吞噬細胞出現(xiàn)。6周時3組均可見材料有所降解，殘余材料周圍環(huán)繞著新生骨組織，并伴有類骨質(zhì)的結(jié)晶層形成，表明成骨過程是由材料周邊逐漸向中心移行的(圖2)。圖像分析顯示，A組和B組新生骨組織與骨缺損區(qū)域的面積比(分別為17.1%±1.0%、14.5%±1.3%)明顯高于C組(10.5%±1.3%，P<0.01)，且A組明顯高于B組(P<0.01)；A組和B組殘余材料與骨缺損區(qū)域的面積比(分別為21.1%±0.8%、24.1%±1.8%)明顯低于C組(32.9%±0.9%，P<0.01)，且A組明顯低于B組(P<0.01)。12周時，伴隨著材料的逐步降解，3組新生骨組織進一步增多，可觀察到成熟骨小梁的形成，與6周時相比骨小梁板層增粗變大(圖2)。圖像分析顯示，A組和B組新生骨組織與骨缺損區(qū)域的面積比(分別為23.8%±1.1%、20.3%±1.1%)高于C組(15.9%±1.2%，P<0.01)，且A組明顯高于B組(P<0.01)；A組和B組殘余材料與骨缺損區(qū)域的面積比(分別為12.0%±1.0%、15.1%±1.4%)明顯低于于C組(19.7%±1.3%，P<0.01)，且A組明顯低于B組(P<0.01)。與6周時比較，12周時3組新生骨量均明顯增加(P<0.01)，殘余材料明顯減少(P<0.01)。

圖2 術(shù)后6周及12周組織學觀察結(jié)果(VG染色 ×100)Fig. 2 Histo log ical im ages of rabb it fem u r 6th and 12th w eek after insertion of m aterials (VG stain ing ×100)Green arrow ind icates the new bone and ye llow arrow ind icates the excess g ra ft

3 討 論

外傷、腫瘤及整形外科手術(shù)等原因均可導致骨組織缺損、功能喪失。為滿足修復(fù)治療的需要，研究者探索了多種修復(fù)骨組織缺損的方法，經(jīng)歷了自體移植、同種異體移植、異種移植、人工組織代用品及組織化人工骨等幾個階段。自體骨移植效果雖好，但自體供骨量嚴重不足，無法滿足較大骨缺損的修復(fù)要求。異體骨、異種骨的免疫排斥反應(yīng)等問題目前仍未徹底解決[22-23]。各種骨替代材料在生物學和力學方面仍有許多缺陷[24]，已在臨床應(yīng)用的一些人工骨材料尚存在不能吸收及爬行替代等問題。骨替代材料成分的不同影響著骨缺損的修復(fù)效應(yīng)，而選擇一種更有利于成骨的生物活性材料是當前亟待解決的問題。

本研究將Ⅰ型膠原纖維分別與生物活性玻璃以及β-磷酸三鈣按一定比例組成不同三維形態(tài)的成骨相關(guān)材料，并觀察其修復(fù)骨缺損的能力和降解性能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ⅰ型膠原不僅具有低免疫原性和良好的生物相容性，還可促進骨的修復(fù)重建[25-27]。本研究結(jié)果顯示，3種包含Ⅰ型膠原的新型生物活性材料均具有良好的生物相容性，骨缺損區(qū)域未發(fā)現(xiàn)排異的炎性反應(yīng)，材料與周圍骨組織能夠完全融合，結(jié)合緊密。術(shù)后6周和12周的X線片及組織學切片分析表明，在成骨能力方面膠原生物玻璃條索>膠原生物玻璃顆粒>含Ⅰ型膠原的β-TCP(P<0.05)，而材料的降解性能也與成骨能力相一致，即膠原生物玻璃條索>膠原生物玻璃顆粒>含Ⅰ型膠原的β-TCP(P<0.05)。這可能是由于膠原生物玻璃材料中Ⅰ型膠原與45S5的比例更適合新生骨的爬行替代，以及生物玻璃的顆粒直徑(32～2500μm)相對于大小不定的β-TCP來說具有更好的生物活性。此外，可能由于膠原生物玻璃顆粒中Ⅰ型膠原與45S5顆粒結(jié)合不夠緊密，致使膠原過早過快降解，導致骨缺損區(qū)出現(xiàn)大量空洞，從而使剩余的材料不能充分與周圍骨組織接觸，最終影響到其成骨和剩余材料的降解。本實驗結(jié)果還間接證實膠原生物玻璃條索材料的降解與骨組織的再生填充是同步的，可避免材料降解過快而骨組織生長緩慢導致的缺損不愈合的發(fā)生。

因此，在生物活性骨替代材料的制備過程中，不僅要考慮選用什么樣的材質(zhì)，還要考慮到材料的三維形態(tài)。本研究結(jié)果表明膠原生物玻璃條索在成骨能力和降解性能方面優(yōu)于其他兩種材料，提示其可作為一種新型的生物活性骨移植材料，為進一步深入研究奠定了基礎(chǔ)。

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