慢病毒載體介導增強型綠色熒光蛋白轉染大鼠角膜的效率及其毒性研究

劉立，趙敏

與其他病毒比較，慢病毒具有轉染效率高、遺傳表達穩(wěn)定、能感染多種細胞等優(yōu)勢[1]，近年來開始用于眼科研究。眼球具有易于操作和觀察的特點，是眼科基因治療的優(yōu)勢之一。選擇最佳的給藥途徑以作用于靶向組織是當前基因治療研究的熱點。有學者通過角膜基質注射和刮除角膜上皮敷貼兩種途徑進行慢病毒轉染，發(fā)現角膜基質注射效率更高，但該操作技術要求較高[2]，且對角膜有明顯的侵襲性，需要尋找其他更簡便高效的轉染途徑。慢病毒載體來源于人免疫缺陷病毒1型、2型(HIV-1、HIV-2)，貓免疫缺陷病毒(FIV)和猿免疫缺陷病毒(SIV)[3]。研究發(fā)現，將反轉錄病毒載體轉染造血干細胞后移植，可導致X染色體連鎖重癥聯合免疫缺陷(SCID-X1)患者發(fā)生白血病，表明病毒載體的使用存在一定安全問題[4]。本實驗觀察并分析慢病毒載體介導的增強型綠色熒光蛋白(LV-EGFP)轉染大鼠角膜的效率及其毒性，以篩選慢病毒轉染角膜的最佳途徑，為臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要器材 SPF級健康成年SD大鼠25只，體重160～180g，雌雄不限(重慶醫(yī)科大學動物實驗室提供)，大鼠的相關處理符合美國眼科協(xié)會有關規(guī)定。慢病毒載體LV-EGFP(元件順序為mU6-MCS-Ubi-EGFP，上海吉凱基因公司合成)。倒置熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)。RPMI 1640培養(yǎng)液及2%熱滅活的胎牛血清(FCS，Hyclone公司，美國)，硫酸鏈霉素及青霉素(華北制藥華勝有限公司)，L-谷氨酰胺(Invitrogen公司，美國)。

1.2 實驗分組 原始病毒滴度測定為1.5×109TU/ml，使用Enhanced Infection Solution進行稀釋，轉染前1h使用聚凝胺(濃度為10μg/ml)與慢病毒進行等體積充分混合，并靜置于4℃冰箱。按照完全隨機分組法分組。感染復數(multiplicity of infection，MOI)以大鼠角膜內皮細胞為目標細胞計算。A組：MOI=5點眼組；B組：MOI=5結膜下注射組；C組：MOI=10點眼組；D組：MOI=10結膜下注射組；E組：MOI=10離體轉染組。MOI=5和MOI=10分別對應病毒量為3×105TU/角膜和6×105TU/角膜，稀釋后的體積分別為5μl及10μl。A、B組以及C、D組分別來自同一大鼠的左眼及右眼。A、B組共用10只大鼠，C、D組共用10只大鼠(在實驗過程中A、B組大鼠和C、D組大鼠各死亡1只，實際統(tǒng)計數據分別為9只)，離體轉染組使用5只大鼠。

1.3 轉染模型的建立 活體轉染：所有大鼠均采用10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射進行全身麻醉，并聯合使用1%鹽酸奧布卡因進行眼部局麻。轉染前1h使用聚凝膠(濃度為10μg/ml)與慢病毒進行等體積充分混合，并靜置于4℃冰箱。待大鼠麻醉效果滿意后，結膜下注射組用微量注射器于右眼9點位角膜緣外約2mm結膜處進針，緩慢注射，注射完畢后以棉簽輕按注射處，迅速退出針頭，以防止病毒液在針頭退出時被帶出。點眼組使用微量注射器將病毒液緩慢均勻滴注到大鼠角膜表面。因大鼠結膜囊容量有限，共分3次滴完，每次間隔2min。各組大鼠每日給予病毒1次，連續(xù)7d。

離體轉染：取出以水合氯醛過量麻醉處死的大鼠眼球，采用10%聚維酮碘持續(xù)沖洗2min，平衡液沖洗2次，洗凈聚維酮碘；沿距角膜緣周圍1～2mm，以角膜緣為同心圓將角膜及鞏膜一同剪下，將其置于96孔板內。將LV-EGFP以6×105TU/角膜(即MOI=10)加入孔中，同時加入離體培養(yǎng)液(RPMI 1640培養(yǎng)液、100U/ml青霉素、100mg/ml硫酸鏈霉素、2mmol/L谷氨酰胺和2%熱滅活FCS)2ml進行轉染，每次轉染時間6h，每24h更換離體培養(yǎng)液及病毒液，連續(xù)7d后取出角膜。

1.4 角膜熒光觀察 活體轉染組轉染7d后于顯微鏡下完整取下雙眼角膜，離體轉染組直接從轉染液中取出，置于4%多聚甲醛中固定24h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后進行連續(xù)切片，厚度約為6μm，置于烤箱烘干后在熒光顯微鏡下觀察熒光強度及分布情況并拍照。

1.5 HE染色及觀察 將已經切片的角膜組織行常規(guī)HE染色，并于顯微鏡下觀察各組角膜細胞的形態(tài)，有無炎性細胞浸潤，有無凋亡細胞，以確定慢病毒對角膜細胞是否存在毒性。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有圖片均在同一顯微鏡下觀察，拍攝參數均相同，且于同一天拍攝完成。熒光圖片采用Image Pro Plus 6.0軟件進行處理，將熒光強度轉換為光密度(A)值，數據資料以x±s表示。相同MOI值組別之間比較采用配對t檢驗，不同MOI組之間比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 熒光顯微鏡下熒光分布情況 各組角膜全層出現明顯熒光表達，主要分布于上皮細胞和內皮細胞，較基質細胞表達增強。點眼方式轉染角膜熒光分布均勻，全層角膜出現較強熒光表達，角膜細胞形態(tài)未見明顯改變。結膜下注射方式轉染角膜全層均有熒光分布，但分布不均勻，主要成團分布于角膜內皮細胞附近。離體轉染全角膜呈強熒光表達，近內皮細胞處可見少許成團分布(圖1)。

2.2 角膜熒光強度比較 各組熒光強度分別為：A組0.1803±0.0440，B組0.1061±0.0434，C組0.2369±0.0157，D組0.2002±0.0307，E組0.2434±0.0173。相同MOI不同轉染途徑兩組比較(A組與B組、C組與D組比較)，點眼方式的熒光表達較結膜下注射方式更加強烈(P<0.05)。相同轉染方式的兩組相比(A組與C組、B組與D組比較)，高MOI組熒光表達更強烈(P<0.05)。E組熒光強度與C組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但與其他各組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3 HE染色觀察 各組角膜結構完整，各細胞層次清晰，層間未見炎性細胞分布，未見新生血管，細胞形態(tài)正常，未見明顯細胞凋亡。離體轉染角膜經7d培養(yǎng)液轉染后，角膜內皮細胞仍然生長良好，未見內皮細胞皺縮、變形及缺失等病理改變(圖2)。

圖2 大鼠角膜病理分析(HE ×100)Fig.2Histopathologic image of rat cornea (HE ×100)

3 討 論

EGFP報告基因在反轉錄病毒、腺病毒等載體轉移系統(tǒng)中被廣泛用于基因轉移效率的評估。本實驗首先建立了3種不同角膜轉染途徑的動物模型，即點眼方式、結膜下注射方式和離體角膜轉染方式。這3種轉染方法簡便易行，其中點眼和結膜下注射為眼科最常用的給藥方式，便于實施。分析角膜熒光強度發(fā)現，在相同MOI條件下，點眼方式的角膜熒光強度高于結膜下注射方式(P<0.05)，且熒光在角膜的分布更為均勻。結膜下注射角膜熒光強弱不均，較強熒光主要出現在角膜內皮層附近。導致點眼方式轉染效率較高的原因可能與點眼后藥物主要分布于眼前節(jié)組織如結膜、角膜、房水等有關，結膜下注射除上述組織獲得高度藥物濃度外，晶體和玻璃體內亦存在一定量藥物，其分布范圍廣于點眼方式。因此，在相同MOI條件下，通過結膜下注射方式進入角膜的病毒數量少于點眼方式。

離體轉染方式角膜熒光強度與同濃度點眼方式差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，可能與房水-角膜屏障和角膜上皮屏障有關。一方面，角膜內皮細胞間形成緊密連接，不僅可阻止房水進入細胞外間隙，具有角膜-房水屏障功能，而且能主動泵出水分，阻止房水進入角膜基質內而致角膜基質層水腫，維持角膜相對脫水狀況。從采用結膜下注射的B、D兩組結果可以看出，通過房水進入角膜的慢病毒主要集中在角膜內皮層附近，且成團狀分布。另一方面，角膜中成熟的上皮細胞分布于整個角膜上皮層，由角膜邊緣向角膜中心遷移，并覆蓋于角膜頂端，最頂端的角膜上皮細胞為緊密連接，限制了細胞間藥物的滲透以及病菌的通過[5]。從各組角膜熒光強度可以看出，EGFP主要表達于角膜上皮和角膜內皮細胞，基質細胞表達較少。另外，可能由于病毒量較少，MOI是根據內皮細胞數量計算的，而內皮細胞在角膜的3層結構中數量最少，以致病毒數量不能保證整個角膜的細胞都能很好地感染病毒。A、C組以及B、D組在相同轉染途徑下，熒光強度比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明隨著病毒濃度升高，病毒轉染效率提高，EGFP在角膜上的表達增多。

在低MOI病毒感染情況下5組角膜細胞均未發(fā)生病理改變，各組角膜細胞形態(tài)完整，各層結構清晰。采用離體方式對角膜進行長時間持續(xù)轉染后，角膜內皮細胞生長良好，未見缺失，表明角膜在低MOI慢病毒感染條件下安全、無毒性。

慢病毒載體可以感染多種細胞，包括分裂細胞和非分裂細胞[6]，更有研究指出，慢病毒載體可以轉染所有哺乳動物細胞[7]，表明可將其用于T淋巴細胞的轉染，以解決角膜移植免疫排斥反應的問題。慢病毒載體的優(yōu)勢在于來源廣泛，易于大量獲得，感染效率較高，可穩(wěn)定而長期地表達目的基因，且不會引起非特異性反應[8-9]。載體的正確選擇是轉染成功的關鍵因素，本實驗中使用的慢病毒來源為HIV-1。

轉染途徑是將慢病毒成功運用于活體轉染的另一重要因素。由于眼球部位的特殊性，即其位于人體體表，且角膜位于眼球外層，使得角膜轉染途徑便利且易于觀察。從本實驗來看，對比兩種眼科臨床最常用的給藥方式，點眼方式能更好地感染角膜。從給藥簡便性和患者依從性來看，點眼方式均明顯優(yōu)于侵入性操作的結膜下注射。本實驗為點眼給藥途徑用于慢病毒轉染提供了良好的依據。

綜上所述，LV-EGFP能在較低MOI下有效轉染大鼠角膜，且點眼方式比結膜下注射的轉染效率更高，而提高MOI可提高角膜轉染的效率，大鼠角膜在較低MOI下持續(xù)轉染的安全性良好。但本實驗只探討了低MOI情況下慢病毒對角膜的毒性作用，如果需使用更高濃度的慢病毒用于角膜的基因治療，則需要對其遺傳毒性進行更全面和深入的研究。

[1]Yang J, Lu Y, Guo LH, et al. Construction of bicistronic lentiviral vectors carrying HSV-tk and EGFP gene [J]. Chin J Ophthalmol,2007, 43(5): 387-392. [楊晉, 盧奕, 郭禮和, 等. 綠色熒光蛋白和胸苷激酶基因共表達的慢病毒載體的構建及表達[J].中華眼科雜志, 2007, 43(5): 387-392.]

[2]Bin L, Du ZY, Xu YC. Study on the effectiveness of Lentidviral vector-mediated enhanced green fluorescent protein transfection in vivo via two ways of corneal stromal cells in rats [J]. Laser J,2011, 32(2): 57-59. [賓莉, 杜之渝, 許寅聰. 慢病毒載體介導增強型綠色熒光蛋白兩種途徑體內轉染大鼠角膜基質細胞有效性的試驗研究[J]. 激光雜志, 2011, 32(2): 57-59.]

[3]Chen CY, Liu YJ, Niu ZY. Research and application of lentiviral vectors carrying [J]. Chin J Prosthodont, 2012, 13(2): 117. [陳彩云, 劉亞京, 牛忠英. 慢病毒載體的研究進展及應用[J]. 口腔頜面修復學雜志, 2012, 13(2): 117.]

[4]Hacein-Bey-Abina S, Von Kalle C, Schmidt M, et al. LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1[J]. Science, 2003, 302(5644): 415-419.

[5]Mannermaa E, Vellonen KS, Urtti A. Drug transport in corneal epithelium and blood--retina barrier: emerging role of transporters in ocular pharmaeokinefics[J]. Adv Drug Deliv Rev,2006, 58(11): 1136-1163.

[6]Gao SF, Zhang SR, Xu L, et al. Effect of small interfering RNA targeting CD47gene mediated by lentivirus vectors on proliferation and apoptosis of human laryngocarcinoma Hep-2cells[J]. Med J Chin PLA, 2013, 38(8): 634-638. [高樹峰, 張少容, 徐蓮, 等. 慢病毒介導的siRNA靶向CD47基因對人喉癌細胞Hep-2增殖、凋亡的影響[J]. 解放軍醫(yī)學雜志, 2013,38(8): 634-638.]

[7]Naldini L, Blomer U, Gallay P, et al. In vivo gene delivery and stable transduction of non dividing cells by a lentiviral vector[J].Science, 1996, 272(5259): 263-267.

[8]Wang XF, He YL, Liu MB, et al. Effect of lentiviral-mediated Bcl-2gene on primary human ovarian granulosa cells[J]. Med J Chin PLA, 2012, 37(8): 760-764. [王雪峰, 何援利, 劉木彪, 等. 攜帶Bcl-2基因的慢病毒對原代培養(yǎng)的人卵巢顆粒細胞的影響[J]. 解放軍醫(yī)學雜志, 2012, 37(8): 760-764.]

[9]Wang L, Xu XH, Zhang NK, et al. Transfection of lentivirus recombined with marker gene into human umbilical cord Wharton's Jelly-derived mesenchymal stem cells[J]. Tianjin Med J, 2013, 41(10): 985-988. [王力, 徐小紅, 張寧坤, 等. 攜帶標記基因的慢病毒載體轉染人臍帶華通膠間充質干細胞的實驗研究[J]. 天津醫(yī)藥, 2013, 41(10): 985-988.]