烏司他丁對(duì)黑火藥煙霧所致吸入性肺損傷大鼠的保護(hù)作用以及對(duì)IL-1β、TNF-α基因表達(dá)的抑制作用

劉一凡，王正冠，唐紅衛(wèi)，吳小利，謝尹晶，張洪瑞，李登清，王成彬

吸入性肺損傷是指因吸入熱力或化學(xué)性刺激物而引起的呼吸道以至肺實(shí)質(zhì)的損害，往往也是導(dǎo)致嚴(yán)重全身性病變的重要原因。黑火藥被廣泛應(yīng)用于軍事和民用方面，如戰(zhàn)爭(zhēng)、演習(xí)或煙花爆竹的燃放等，在爆炸、燃燒過程中所釋放的有毒氣體及粉塵顆粒會(huì)引發(fā)急性吸入性肺損傷，造成肺組織充血、水腫及炎性細(xì)胞浸潤等[1-2]。體外研究表明，黑火藥煙霧會(huì)導(dǎo)致支氣管上皮細(xì)胞炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-8表達(dá)增加，活性氧相對(duì)含量增高[3]，而其體內(nèi)損傷機(jī)制尚未明確。烏司他丁(ulinastatin，UTI)作為一種蛋白酶抑制劑，目前在臨床上主要用于胰腺炎的治療。研究發(fā)現(xiàn)，除對(duì)多種蛋白酶、脂水解酶等有抑制作用外，UTI還具有清除氧自由基、抑制炎癥介質(zhì)的過度釋放等功能[4-6]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明UTI對(duì)脂多糖、燒傷及缺血再灌注導(dǎo)致的肺損傷具有保護(hù)作用[7-9]，但是否能減輕煙霧吸入所致的肺損傷尚未見報(bào)道。本研究通過建立黑火藥煙霧所致肺損傷大鼠模型，探討UTI對(duì)煙霧吸入性肺損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性Wistar大鼠30只，體重210～230g，由解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(京)2012-0001。大鼠于清潔房中飼養(yǎng)，溫度21～24℃，濕度50%～60%，晝夜12h節(jié)律，自由進(jìn)食、飲水。

1.2 主要藥物及試劑 烏司他丁(規(guī)格：10萬單位；批號(hào)：031301103；廣東天普生化醫(yī)藥公司)；硝酸鉀、碳粉、硫黃粉(純度99.9%，200目，北京西四化工原料公司)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)及髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(北京TransGen公司)。實(shí)驗(yàn)所用引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物模型制備 30只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(C組)、吸入性肺損傷組(I組)、烏司他丁高劑量組(UH組)、烏司他丁中劑量組(UM組)、烏司他丁低劑量組(UL組)，每組6只。C組大鼠暴露于動(dòng)物煙熏箱的空氣中8min，I組、UH組、UM組、UL組置于動(dòng)物煙熏箱，在10g火藥產(chǎn)生的煙霧中暴露8min，制作黑火藥煙霧吸入性肺損傷模型[1]。UH組、UM組、UL組分別按100000、50000、20000U/(kg.d)計(jì)算出UTI用量，稀釋至3ml，于煙霧吸入后10min經(jīng)腹腔注射，C組、I組注入3ml 0.9% NaCl注射液。所有大鼠均于煙霧暴露后40h經(jīng)腹腔注射4%水合氯醛(1ml/kg)麻醉，暴露分離腹主動(dòng)脈，取動(dòng)脈血1ml，處死并取材。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 動(dòng)脈血?dú)夥治?麻醉大鼠并取腹主動(dòng)脈血1ml，于30min內(nèi)采用羅氏Cobasb血?dú)夥治鰞x進(jìn)行動(dòng)脈血?dú)夥治觥?/p>

1.4.2 肺濕/干重比(W/D) 處死大鼠后取右肺前葉及中葉，拭干表面血液后稱濕重并記錄，然后放入60℃烘箱烘烤48h至恒重并記錄干重，計(jì)算W/D值。

1.4.3 支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)細(xì)胞計(jì)數(shù)及蛋白含量測(cè)定 處死大鼠后，打開胸腔，分離主支氣管，夾閉右主支氣管，在主支氣管切開處置入自制灌洗針并結(jié)扎固定，用4℃生理鹽水2.5ml行左肺灌洗，重復(fù)3次，記錄回收量。BALF經(jīng)1500r/min離心10min，收集上清液，BCA法測(cè)定總蛋白含量，取沉淀重懸于1ml生理鹽水并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.4.4 血清、肺組織MPO活性及肺組織MDA含量測(cè)定 取肺組織100mg，置于液氮中研磨后以1:9比例加入生理鹽水，制成10%的肺組織勻漿，采用MPO及MDA試劑盒測(cè)定肺組織MPO活性及MDA含量，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。大鼠麻醉后取腹主動(dòng)脈血5ml，3000r/min離心5min，測(cè)血清MPO活性，具體操作按照MPO試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.5肺組織Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR-4)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用Trizol試劑盒提取肺組織總RNA。取2μl RNA樣本，加入不含RNA酶的雙蒸水198μl，置于核酸分析儀中測(cè)定純度和濃度，取A260/A280值在1.8～2.0的RNA，采用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，實(shí)驗(yàn)所用引物序列見表1。PCR采用20μl反應(yīng)體系，包括上游引物(10μmol/L)0.5μl，下游引物(10μmol/L)0.5μl，2×TransStart Green qPCRSuperMix 10μl，模板2μl，雙蒸水7μl。擴(kuò)增條件：94℃ 180s；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃60s，共45個(gè)循環(huán)；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s。擴(kuò)增完成后從50℃升溫繪制熔解曲線驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

表1 PCR引物序列Tab. 1Primer sequence for PCR amplification

1.4.6 肺組織病理學(xué)檢查 觀察肺組織大體病理改變，取右肺后葉浸入4%中性緩沖甲醛溶液中固定24h，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，常規(guī)HE染色后光鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布及方差齊性的計(jì)量資料以±sx表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果 與C組比較，在暴露于黑火藥煙霧40h后，I組PaO2明顯降低，PaCO2明顯升高(P＜0.05)。給予不同劑量UTI處理后，UH、UM、UL組PaO2均高于I組(P＜0.05)，UM與UL組PaCO2水平低于I組(P＜0.05)，3組PaO2、PaCO2與C組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表2)。

2.2 肺W/D及BALF白細(xì)胞計(jì)數(shù)、蛋白含量測(cè)定結(jié)果 I組肺W/D顯著高于C組和使用UTI治療的三組(P＜0.05)，而C組與使用UTI治療的3組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。I組大鼠BALF白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著高于其余4組(P＜0.05)，BALF蛋白含量明顯高于C組及UM組、UL組(P＜0.05)，與UH組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表2)。

2.3 MPO活性及MDA含量測(cè)定結(jié)果 UH組血清、肺組織MPO活性及肺組織MDA含量均低于I組(P＜0.05)，且與C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。UM、UL組血清MPO活性顯著低于I組(P＜0.05，表3)。

表2 煙霧吸入后40h各組PaCO2、PaO2、W/D及BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)和蛋白含量比較(±sx，n=6)Tab. 2Arterial blood gas analysis, WBC count and protein contents in BALF of 5groups at 40h post smog inhalation (±sx, n=6)

表2 煙霧吸入后40h各組PaCO2、PaO2、W/D及BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)和蛋白含量比較(±sx，n=6)Tab. 2Arterial blood gas analysis, WBC count and protein contents in BALF of 5groups at 40h post smog inhalation (±sx, n=6)

(1)P＜0.05compared with group C; (2)P＜0.05compared with group I

Group PaO2 (mmHg) PaCO2 (mmHg) W/D BALF WBC (×105/ml) Protein (μg/ml)C 83.3±2.0 45.8±2.4 4.51±0.08 3.85±0.72 188.2±11.8I 55.5±10.1(1) 55.0±4.0(1) 5.03±0.06(1) 30.85±2.92(1) 1528.1±413.1(1)UH 71.6±3.3(2) 48.3±1.4 4.72±0.11(2) 9.22±0.86(2) 882.1±152.0UM 74.9±4.2(2) 46.6±2.1(2) 4.69±0.06(2) 9.15±2.41(2) 717.7±89.0(2)UL 74.6±3.4(2) 43.8±1.4(2) 4.63±0.12(2) 11.76±3.58(1)(2) 764.3±38.2(2)

2.4 肺組織TLR-4、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)水平

各組之間TLR-4mRNA表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖1)。UH組IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)均低于I組(P＜0.05)，且與C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；UM、UL組IL-1βmRNA表達(dá)顯著低于I組(P＜0.05)，而TNF-α mRNA表達(dá)與I組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖1)。

2.5 病理學(xué)檢查結(jié)果 大體觀察見C組大鼠肺組織呈肉粉色，質(zhì)地柔軟、彈性好。I組大鼠肺表面可見片狀出血壞死灶，彈性較差。UH、UM、UL組肺表面觀無明顯差異，整體呈肉紅色，彈性尚可，UL組偶見點(diǎn)狀出血梗死灶。光鏡下可見C組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整、清晰，肺泡腔干凈，肺泡間隔均勻一致，間質(zhì)無炎細(xì)胞浸潤；煙霧吸入后40h的I組大鼠肺泡腔增大，肺泡間隔增厚，腔內(nèi)可見滲出，肺泡間質(zhì)可見炎細(xì)胞浸潤；UH組、UM組肺泡間質(zhì)炎性浸潤均較I組明顯減輕，肺泡腔內(nèi)未見滲出，UL組肺泡腔內(nèi)滲出情況及炎細(xì)胞浸潤現(xiàn)象也較I組減輕(圖2)。

表3 煙霧吸入后40h各組血清、肺組織MPO活性及肺組織MDA含量比較(x±sx，n=6)Tab. 3MPO activity in serum and lung tissue and MDA concentration in lung tissue at 40h post smog inhalation (x±sx, n=6)

圖1 煙霧吸入后40h各組TLR-4、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)水平比較(n=6)Fig. 1Expression levels of TLR-4, IL-1β and TNF-α mRNA in 5groups at 40h post smog inhalation (n=6)

3 討 論

研究認(rèn)為，吸入性肺損傷發(fā)生的主要原因?yàn)楫?dāng)機(jī)體吸入熱力物質(zhì)、有毒氣體或刺激性粉塵后，導(dǎo)致單核巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等的活化和積聚，釋放MPO、氧自由基及多種炎性細(xì)胞因子等，同時(shí)，因中性粒細(xì)胞與肺組織內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生黏附而阻塞肺組織內(nèi)微血管，加重局部組織缺血缺氧，使血管內(nèi)皮通透性增加，進(jìn)一步加速肺組織水腫的發(fā)生，最終加重肺部炎癥反應(yīng)[11-12]。

目前，以地塞米松為代表的糖皮質(zhì)激素類藥物在抗炎治療中應(yīng)用較為廣泛，該類藥物具有較強(qiáng)的免疫抑制作用，能廣泛調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)多種炎性介質(zhì)的表達(dá)，但因其會(huì)產(chǎn)生藥物依賴、激素抵抗等一系列不良反應(yīng)，故一直不能作為臨床治療的最佳選擇。UTI是一種由肝臟分泌的具有廣譜蛋白酶抑制作用的糖蛋白，屬于內(nèi)源性抑炎介質(zhì)。在由細(xì)菌內(nèi)毒素所致的急性肺損傷大鼠模型中，UTI能有效抑制TNF-α水平和MPO活性的升高，減輕肺泡間隔炎性細(xì)胞的浸潤、水腫、出血等，也可通過降低IL-18等炎性因子及NF-κB的表達(dá)，減輕肺部炎性反應(yīng)[13-14]。

圖2 肺組織病理學(xué)觀察(HE ×100)Fig. 2Histopathological observation of the lung tissues (HE ×100)

本研究使用自制的發(fā)煙裝置建立了黑火藥煙霧所致大鼠吸入性肺損傷模型，使用高、中、低3個(gè)劑量的UTI進(jìn)行干預(yù)。血?dú)夥治鼋Y(jié)果表明UTI可顯著改善吸入性肺損傷大鼠的PaO2，使之恢復(fù)正常水平，同時(shí)有效降低了UM組、UL組的PaCO2水平(P＜0.05)。UH組PaCO2水平略低于I組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，考慮與大鼠數(shù)量有限或血?dú)鉁y(cè)定時(shí)點(diǎn)差異有關(guān)。肺組織W/D以及BALF中蛋白含量是衡量肺內(nèi)微血管通透性的主要指標(biāo)，本研究結(jié)果顯示，與I組相比，UTI能有效降低W/D值，同時(shí)減少蛋白滲出(P＜0.05)，與Qiu等[11]的研究結(jié)果一致。UH組BALF中蛋白含量雖與I組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但數(shù)值仍低于后者，考慮可能是在收集BALF時(shí)因操作不當(dāng)使標(biāo)本混入了溶血后的血液，從而導(dǎo)致所測(cè)定的蛋白水平假性增高。

MPO活性是組織中性粒細(xì)胞浸潤的主要標(biāo)志。本研究結(jié)果顯示高劑量UTI能顯著降低血清及肺組織MPO的活性(P＜0.05)，且與BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化趨勢(shì)一致，提示UTI能有效抑制中性粒細(xì)胞的滲出以及MPO的釋放，減輕肺組織損傷，從而起到保護(hù)作用。與UH組相比，UM、UL組肺組織MPO活性下降不明顯(P＞0.05)，考慮與UTI劑量有關(guān)。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，其含量可反映組織中自由基的多少及脂質(zhì)過氧化程度。I組MDA含量增加表明黑火藥煙霧吸入可破壞肺組織的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，而UH組肺組織MDA含量與I組相比顯著下降(P＜0.05)，表明高劑量UTI具有抗氧化作用。

TLR-4是目前研究較為廣泛的病原微生物模式識(shí)別受體，本研究結(jié)果顯示TLR-4mRNA表達(dá)在各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示在黑火藥煙霧吸入引起的無菌性炎癥中，TLR-4相關(guān)炎性通路可能未被激活。TNF-α是感染、燒傷等炎癥反應(yīng)中最主要的促炎性細(xì)胞因子，主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可通過誘導(dǎo)IL-1β等其他細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)進(jìn)一步啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，高劑量UTI可顯著抑制TNF-α及IL-1β mRNA的表達(dá)(P＜0.05)，而中、低劑量UTI則僅可減少IL-1β mRNA的表達(dá)(P＜0.05)，提示高劑量UTL對(duì)煙霧吸入引起的肺損傷可發(fā)揮有效的保護(hù)作用。上述結(jié)果與病理觀察變化趨勢(shì)一致。

綜述所述，本研究結(jié)果顯示UTI可通過抗炎、抗氧化對(duì)黑火藥煙霧所致大鼠肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用，且高劑量UTI可通過有效抑制IL-1β、TNF-α mRNA的表達(dá)起到更為顯著的保護(hù)效果。

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