烏司他丁對(duì)老年小鼠術(shù)后中樞炎癥反應(yīng)及學(xué)習(xí)記憶能力的影響

董浩林，李文瑤，龐久明，陶國(guó)才

(1.解放軍第210 醫(yī)院分院 麻醉科，遼寧 大連116031;2 第三軍醫(yī)大學(xué) 西南醫(yī)院 麻醉科，重慶400038)

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)是老年人臨床術(shù)后常見并發(fā)癥，臨床表現(xiàn)為以記憶下降為主的認(rèn)知功能下降［1］。POCD 高發(fā)于老年人，中樞炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是術(shù)后認(rèn)知功能障礙的重要發(fā)病機(jī)制之一。烏司他丁(Ulinastatin，UTI)是從人體尿液中提取的尿胰蛋白酶抑制劑，能抑制多種蛋白、糖和脂類水解酶的活性，減少炎性介質(zhì)的過(guò)度釋放，改善微循環(huán)和組織灌注。本課題觀察了烏司他丁能否通過(guò)抑制中樞炎癥反應(yīng)改善老年小鼠術(shù)后認(rèn)知功能。

1 材料和方法

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用17月齡老年雄性C57 小鼠，由重慶科邁公司提供。小鼠飼養(yǎng)于飼養(yǎng)室，飼養(yǎng)室濕度60%左右，溫度23 ～25 ℃，光線良好，12 h 晝夜交替，小鼠隨意進(jìn)食，取水。

1.2 方 法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及模型制備:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為對(duì)照組(C 組)，手術(shù)組(S 組)，烏司他丁組(W 組)。每組30 只，12 只進(jìn)行水迷宮測(cè)試，18 只于手術(shù)結(jié)束后1、3、7 天取海馬進(jìn)行PCR 實(shí)驗(yàn)，每次6 只。

S 組及W 組小鼠采用小鼠剖腹探查模型，5%水合氯醛(4 ～6 mL/kg)腹腔注射麻醉，麻醉成功后，W 組使用烏司他丁腹腔注射(10 000 U/mL，100 U/g)。手術(shù)組使用生理鹽水腹腔注射(0.5 mL)。10 min 后消毒腹部皮膚，取正中切口，長(zhǎng)約3 cm，止血后依次探查腹腔器官，每10 min 探查1 次，每次約1 min。共探查3 次后依次縫合腹腔，皮下注射丁丙諾啡術(shù)后鎮(zhèn)痛。手術(shù)共進(jìn)行約40 min。對(duì)照組不進(jìn)行手術(shù)。

1.2.2 Morris 水迷宮(Morris water maze)行為訓(xùn)練和測(cè)試［2］:Morris 水迷宮儀器為直徑120 cm，高50 cm 的圓形水池，水色為不透明黑色，在水池邊緣上等距離設(shè)東、西、南、北4 個(gè)標(biāo)記點(diǎn)，將水池均等地分為4 個(gè)象限。水池水深30 cm，在第3 象限正中距池壁30 cm 放1 圓形透明站臺(tái)，水面高出站臺(tái)表面1.5 cm。水溫控制在(22. 0 ±0. 5)℃。各組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前1 天分別放入水中2 min 適應(yīng)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)在隔音的房間內(nèi)進(jìn)行，水池、光源、鼠籠、站臺(tái)等實(shí)驗(yàn)室各物件的位置保持不變。(1)定位航行實(shí)驗(yàn)(place navigationtest):實(shí)驗(yàn)歷時(shí)6 d，前3 天作為訓(xùn)練，后3 天作為測(cè)試成績(jī)。每只小鼠每天訓(xùn)練4 次，每次從不同的象限采用隨機(jī)的入水點(diǎn)，每次實(shí)驗(yàn)以60 s 為限，實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠面朝池壁輕輕放入水中，同時(shí)計(jì)算機(jī)自動(dòng)記錄小鼠從入水點(diǎn)到達(dá)站臺(tái)所需時(shí)間(潛伏期)作為學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)。小鼠找到并爬上站臺(tái)后，讓其停留30 s;若小鼠入水后60 s 內(nèi)未能找到或爬上站臺(tái)，則將其放置于站臺(tái)上站立30 s(記錄為60 s)。然后將小鼠從站臺(tái)上取下休息至少30 min，再進(jìn)行下一次訓(xùn)練。記錄小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間，即逃逸潛伏期(Escapelatency)4 次平均值作為當(dāng)天數(shù)據(jù)記錄。(2)空間探索實(shí)驗(yàn)(Spatialprobetest):訓(xùn)練完畢次日進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤除平臺(tái)，記錄小鼠60 s 內(nèi)穿過(guò)原平臺(tái)位置的次數(shù)作為空間記憶成績(jī)。

1.2.3 IL-1β，TNF-α mRNA RT-PCR 檢測(cè):分離海馬，Trizol 法分別提取組織細(xì)胞總RNA，紫外分光光度法定量后，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，反轉(zhuǎn)錄條件:42 ℃10 min，30 ℃20 min，99 ℃5 min，4 ℃5 min。以引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5. 0 設(shè)計(jì)IL-1β，TNF-α 及內(nèi)參β-actin 引物IL-1beta 上游基因序列:GCCCATCCTCTGTGACTC，下游基因序列:TGTGCCGTCTTTCATTAC. TNF -a 上游基因序列:GGAACTGGCAGAAGAGGC，下游基因序列:CACTTGGTGGTTTGCTACG。β - actin 上游基因序列:GCATTGTGGAAGGGCTCA ，下游基因序列:GGGTAGGAACACGGAAGG。取5 μL 樣品，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收結(jié)果。1 μL DNA 樣本作為PCR 擴(kuò)增模板，陰性對(duì)照擴(kuò)增模板為去離子水;擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性2 min;隨后95 ℃10 s，退火溫度15 s，72 ℃延伸45s，共40 個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min，使用加權(quán)計(jì)算結(jié)果進(jìn)行相對(duì)灰度值對(duì)比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析(one—wayANOVA)以及PostHocTests 多重比較檢驗(yàn)(MultipleComparisons)LSD 法。

2 結(jié) 果

2.1 逃逸潛伏期結(jié)果

術(shù)后4 ～6 天，手術(shù)組(S 組)小鼠平均逃逸潛伏期相比對(duì)照組(C 組)3 天具明顯上升，學(xué)習(xí)記憶功能下降(P ＜0.01)。烏司他丁組(W 組)平均逃逸潛伏期相比手術(shù)組明顯下降，表明學(xué)習(xí)記憶功能改善(P ＜0.01)(表1)。同一天內(nèi)，相同年齡組游泳速度無(wú)差異(表2)。

表1 逃逸潛伏期Tab 1 The escape latency ( ± s)

1)與對(duì)照組C 組比較，P ＜0.01;2)與手術(shù)組S 組比較，P ＜0.01

組別 第4 天 第5 天 第6天C 組29.60 ±2.2 23.00 ±2.7 20.20 ±2.6 S 組 46.03 ±5.31) 38.17 ±4.21) 30.38 ±3.21)W 組 30.84 ±4.11)2) 26.99 ±3.51)2) 24.60 ±2.71)2

表2 定位航行實(shí)驗(yàn)小鼠游泳速度Tab 2 The mice Place navigation test Swimming speed( ± s)

表2 定位航行實(shí)驗(yàn)小鼠游泳速度Tab 2 The mice Place navigation test Swimming speed( ± s)

組別 第4 天 第5 天 第6天C 組227 ±25.13 238 ±27.47 231 ±19.97 S 組 219 ±31.83 228 ±22.24 238 ±21.35 W 組238 ±30.95 227 ±26.22 234 ±24.78

2.2 空間探索實(shí)驗(yàn)

手術(shù)組(S 組)小鼠穿過(guò)原平臺(tái)次數(shù)(1. 67 ±1.6)相比對(duì)照組(3.50 ±4.5)(C 組)明顯減少，學(xué)習(xí)記憶功能下降(P ＜0.05)。烏司他丁組(W 組)穿過(guò)原平臺(tái)次數(shù)(2.83 ±2.2)相比手術(shù)組明顯上升，學(xué)習(xí)記憶功能改善(P ＜0.05)。相同年齡組游泳速度無(wú)差異。

2.3 海馬炎癥因子PCR 結(jié)果

手術(shù)后1 d，3 d，7 d 手術(shù)組(S 組)IL -1β，TNF-α 表達(dá)較對(duì)照組(C 組)明顯上升(P ＜0.01)，術(shù)后1 d，3 d 烏司他丁組(W 組)相比手術(shù)組抑制了IL-1β 表達(dá)(P ＜0.01)。見表3，4。

表3 IL-1β 表達(dá)相對(duì)灰度值Tab 3 The relative grey value of IL-1β ( ± s)

表3 IL-1β 表達(dá)相對(duì)灰度值Tab 3 The relative grey value of IL-1β ( ± s)

1)與對(duì)照組比較，P ＜0.01;2)與手術(shù)組比較，P ＜0.01

組別 C 組 S 組 W組1 d 0.55 ±0.043 2.48 ±0.261) 1.61 ±0.291)2)3 d 0.55 ±0.043 2.23 ±0.211) 1.53 ±0.321)2)7 d 0.55 ±0.43 1.55 ±0.871) 1.38 ±0.341)

表4 TNF-α 表達(dá)相對(duì)灰度值Tab 4 The relative grey value of TNF-α ( ± s)

表4 TNF-α 表達(dá)相對(duì)灰度值Tab 4 The relative grey value of TNF-α ( ± s)

1)與對(duì)照組比較，P ＜0.01;2)與手術(shù)組比較，P ＜0.01

組別 C 組 S 組 W組1 d 0.52 ±0.051 2.19 ±0.291) 1.49 ±0.321)2)3 d 0.52 ±0.051 2.07 ±0.321) 1.46 ±0.271)2)7 d 0.52 ±0.051 1.51 ±0.211) 1.45 ±0.321)

3 討 論

POCD 主要發(fā)生于老年人，發(fā)病率較高，發(fā)病機(jī)制不清。據(jù)國(guó)際術(shù)后認(rèn)知功能障礙研究組織一項(xiàng)多中心，大樣本研究發(fā)現(xiàn)60 歲以上的患者行非心臟大手術(shù)后1 周POCD 的發(fā)生率為25.8%，3 個(gè)月時(shí)為9.9%，且POCD 發(fā)病與術(shù)中低血壓，低氧血癥無(wú)關(guān)［1］。為了保護(hù)小鼠的運(yùn)動(dòng)功能，本實(shí)驗(yàn)術(shù)中未監(jiān)測(cè)小鼠的血壓，血氧。POCD 發(fā)病與手術(shù)類型相關(guān)，臨床腹部手術(shù)是發(fā)病率較高的手術(shù)［3］，研究認(rèn)為剖腹探查手術(shù)建立POCD 模型發(fā)病率較高［4］。本組前期實(shí)驗(yàn)也證實(shí)剖腹探查手術(shù)對(duì)循環(huán)影響較小，可成功地建立POCD 模型。

水迷宮是現(xiàn)今國(guó)際上常用的評(píng)估小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的模型。實(shí)驗(yàn)程序包括:(1)定位航行實(shí)驗(yàn)(place navigation test，PNT)，用于測(cè)量小鼠對(duì)水迷宮學(xué)習(xí)和記憶獲取能力。潛伏期越短，說(shuō)明學(xué)習(xí)記憶能力越好。(2)空間探索實(shí)驗(yàn)(spatial probe test，SPT):用于測(cè)量小鼠學(xué)會(huì)尋找平臺(tái)后，對(duì)平臺(tái)空間位憶的保持能力。相同時(shí)間內(nèi)，通過(guò)原平臺(tái)次數(shù)越多，說(shuō)明學(xué)習(xí)記憶能力越好。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)手術(shù)可使小鼠潛伏期延長(zhǎng)，穿越原平臺(tái)次數(shù)減少，說(shuō)明手術(shù)可使小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降。使用烏司他丁后進(jìn)行手術(shù)比單純手術(shù)小鼠潛伏期縮短，穿越原平臺(tái)次數(shù)增多，說(shuō)明使用烏司他丁可改善手術(shù)引起的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫異常是神經(jīng)退行性疾病研究的焦點(diǎn)，應(yīng)激、炎癥、手術(shù)等都可激活中樞炎癥反應(yīng)。隨著近年來(lái)對(duì)多種神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)退行性病變(如阿爾茨海默氏癥、帕金森氏癥、多發(fā)性硬化)發(fā)病機(jī)制的研究表明，腦內(nèi)慢性炎癥反應(yīng)可能是其重要病理特征之一，由此提出了此類疾病的炎癥機(jī)制［5-8］。術(shù)后認(rèn)知功能障礙的發(fā)病及老年易感性也被認(rèn)為與中樞免疫反應(yīng)異常造成的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［9］。

烏司他丁(Wlinastatin，UTI)是從人體尿液中提取的尿胰蛋白酶抑制劑，能抑制多種蛋白、糖和脂類水解酶的活性，減少炎性介質(zhì)的過(guò)度釋放，改善微循環(huán)和組織灌注。

烏司他丁的中樞保護(hù)作用已有研究證實(shí)［10］。神經(jīng)元特異性烯醇酶(neuron specific enolase，NSE)是神經(jīng)元損傷的敏感性指標(biāo)，具有高度特異性。黃唯佳等［10］發(fā)現(xiàn)烏司他丁可以降低心肺復(fù)蘇后小鼠NSE 含量。陳小莉等［11］發(fā)現(xiàn)烏司他丁在一定程度上減輕CPB 后認(rèn)知功能損傷，有一定的腦保護(hù)作用。但烏司他丁腦保護(hù)的機(jī)制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)烏司他丁能抑制氧自由基的產(chǎn)生，阻抑內(nèi)源性休克因子如心肌頓抑因子(myocardial depressantfactor，MDF)生成，抑制多種炎癥介質(zhì)如腫瘤壞死因子(TNF-α )、血小板活化因子(PAF)、白介素(IL -6，IL-8)等產(chǎn)生［12-15］。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)使用烏司他丁可減少手術(shù)引起的中樞炎癥反應(yīng)，可能與改善手術(shù)引起的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降相關(guān)。

綜上，烏司他丁可能通過(guò)減少手術(shù)引起的中樞炎癥反應(yīng)，起到改善手術(shù)引起的學(xué)習(xí)記憶下降的作用。烏司他丁可能對(duì)POCD 的防治具有一定作用，需要進(jìn)一步研究。

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