安體舒通對糖尿病大鼠腎臟Nephrin 蛋白表達的影響

丁洪成，劉艷紅，廖春分

(1.湖北醫(yī)藥學院 附屬十堰市人民醫(yī)院 內(nèi)分泌科，湖北 十堰442000;2.湖北醫(yī)藥學院 附屬十堰市人民醫(yī)院 藥劑科，湖北 十堰442000)

微量蛋白尿是糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)早期的表現(xiàn)之一，也是促進DN 進展的重要因素。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Nephrin 分子主要在腎小球足細胞中表達，且定位于裂孔膜，對裂孔膜的完整性起著關鍵作用。Nephrin 蛋白表達的缺乏可導致大量蛋白尿及腎功能衰竭［1-2］。安體舒通是一種非選擇性醛固酮受體拮抗劑，大量研究發(fā)現(xiàn)安體舒通對腎臟有很好的保護，通過抗炎、抗氧化應激等作用延緩糖尿病腎病進展［3］，但其對蛋白尿的作用及其作用機制尚未完全闡明。本文旨在通過觀察安體舒通對Nephrin在DN 大鼠腎小球足細胞中表達的影響，探討安體舒通對糖尿病腎病腎臟的保護作用及機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗動物:成年雄性SD 大鼠30 只，體重200 ～250 g，由湖北醫(yī)藥學院動物中心提供，動物許可證號:SCXK(鄂)2011 -0008。

試劑及儀器:鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，美國Sigma 公司;兔抗人nephrin 多克隆抗體，鼠β-action 單克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司。

1.2 實驗方法

分組及模型的制備:建立糖尿病大鼠模型，大鼠隨機選取6 只為正常對照組(NC 組)，其余24 只為實驗組。實驗組禁食12 h 后給予單次腹腔STZ 60 mg/kg，72 h 后尾靜脈采血，血糖儀測定隨機血糖＞16.7 mmol/L 者認為模型成功，血糖低于16.7 mmol/L 的大鼠舍棄，對照組僅予注射等量枸櫞酸緩沖液。8 周后測定BS、UAER，隨機BS ＞16.7 mmol/L、UAER ＞30 mg/kg·d 確定糖尿病腎病模型成立［4］。

給藥方法:正常對照組給予生理鹽水灌胃，糖尿病腎病模型成功后隨機分為DN 組和安體舒通組，每組12 只。安體舒通組給予安體舒通(20 mg/kg，灌胃)1 次/d。對照組和DN 組每天等量生理鹽水灌胃，1 次/d。實驗12 周末，留取標本，處死大鼠。

尿素氮和尿肌酐及尿蛋白的測定:處死大鼠前收集24 h 尿液標本，24 h 尿蛋白測定采用比濁法。Scr、BUN、脂蛋白A 采用自動生化分析儀檢測。

Western Blot 檢測Nephrin 蛋白:取100 mg 腎組織置入0.5 mL RIPA 裂解液中勻漿，4 ℃，12 000 r/min 離心10 min，取上清液，采用BCA 法測蛋白蛋含量。經(jīng)8%SDS-PAGE 電泳，電轉至PVDF 膜上，采用5%脫脂奶粉-TBST 溶液封閉1 h，加入兔抗大鼠Nephrin 一抗4 ℃過夜，洗膜，再用HRP 羊抗兔多克隆二抗雜交，室溫，1h。采用ECL 顯色。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 大鼠一般情況

NC 組大鼠飲食、飲水、尿量、體重都正常，而DN 組出現(xiàn)典型糖尿病癥狀，多飲，多尿，多食，體重減輕，毛色無光澤。經(jīng)安體舒通干預后，糖尿病大鼠三多一少癥狀有所改善。安體舒通組與DN 組大鼠相比，血糖有所下降，但差異無顯著性意義。

2.2 24h 尿蛋白(24hUpro)、血尿素氮(BUN)、肌酐清除率(Ccr)、血脂蛋白A(ApoA)的變化

12 周末，模型組與正常對照組比較，24 h 尿蛋白、肌酐清除率、血尿素氮和血脂蛋白均顯著性升高(P ＜0.05)。經(jīng)安體舒通治療12 周后，安體舒通組與DN 組比較，24h 尿蛋白、血肌酐和血脂蛋白均下降(P ＜0.01)，血尿素氮雖有下降，但差異無顯著性意義(P ＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血尿素氮和血肌酐、24 h 尿蛋白定量和脂蛋白比較Tab 1 Comparison among groups of BUN、Ccr、24hUpro and ApoA ( ± s)

表1 各組大鼠血尿素氮和血肌酐、24 h 尿蛋白定量和脂蛋白比較Tab 1 Comparison among groups of BUN、Ccr、24hUpro and ApoA ( ± s)

1)與NC 組比較，P ＜0.05;2)與DN 組比較，P ＜0.01

組別 BUN(mmol/L) Ccr(μmol/L) 24hUpro(mg/24h)ApoA NC 組(n=6)5.6 ±1.7 41.0 ±5.2 59 ±16 19.1 ±4.8 DN 組(n=12) 10.7 ±2.11) 94.3 ±10.21) 448 ±1021) 150.3 ±22.71)安體舒通組(n=12) 9.9 ±2.3 79.4 ±8.92) 274 ±992) 104.1 ±17.32)

2.3 腎組織Nephrin 蛋白水平的變化

如圖1所示，Western Blot 條帶光密度分析顯示DN 組與NC 組比較，Nephrin 蛋白水平表達下降(P ＜0.01)，而采用安體舒通干預后，Nephrin 蛋白表達較DN 組升高(P ＜0.05)。Nephrin 分子量為185 kD，內(nèi)參β-action 條帶分子量為42 kD。

3 討 論

糖尿糖腎病是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，以微血管病變?yōu)橹鳎缙谝晕⒘堪椎鞍啄驗橹饕Y狀，24 h 尿蛋白定量是診斷早期糖尿病腎病的敏感指標。尿蛋白的發(fā)生主要取決于腎小球濾過膜的功能，濾過膜結構和電荷屏障受損，直接促進了糖尿病腎病的病程進展［5］。本研究結果顯示糖尿病DN 組血肌酐、尿素氮和24 h 尿蛋白均升高，這說明糖尿病腎病模型成功建立，同時糖尿病腎病的大鼠腎組織Nephrin 蛋白水平升高，這與以往的報道一致。

圖1 各組Nephrin 蛋白水平的比較Fig 1 Western Blot analysis of Nephrin expression among three groups

足細胞是腎小球主要濾過屏障之一，其結構和功能的完整性直接影響到尿蛋白的生成。Nephrin是相鄰足細胞間裂孔隔膜的主要特異性蛋白之一，通過細胞信號轉導介導足細胞肌動蛋白骨架的重新排列，從而改變足細胞的形態(tài)與功能［6］。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病的小鼠，腎小球nephrin mRNA 表達在8周、16 周、24 周均表達降低［7］。已有研究顯示糖尿病腎病模型腎組織足細胞及其蛋白標志物nephrin 、podocin 表達水平，且與24 h 尿蛋白呈負相關［8］。

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)與糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展密切相關，在糖尿病狀態(tài)下，腎素血管緊張素系統(tǒng)被激活，腎臟組織局部醛固酮分泌增加，通過鹽皮質激素受體發(fā)揮調(diào)節(jié)水鹽代謝。越來越多研究顯示，醛固酮作為RAAS 下游重要活性分子，在參與足細胞損傷、尿蛋白的生成起著重要作用。足細胞本身可表達具有功能活性的RAAS 系統(tǒng)受體，如血管緊張素II 受體，鹽皮質受體等，足細胞的增殖、凋亡、細胞骨架被證實亦受RAAS 受體系統(tǒng)調(diào)控［9］。隨著“醛固酮逃逸”現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，以醛固酮為靶點的治療顯得重要。Shibata 等［10］采用醛固酮灌注大鼠4 周，發(fā)現(xiàn)其腎小球足細胞足突增寬、節(jié)段性融合、足細胞凋亡增加其標志，其標志蛋白nephrin、podocin 表達明顯下降。Mehdi 的一項臨床試驗中，觀察分別接受安體舒通、氯沙坦及安慰劑治療的糖尿病患者48 周，發(fā)現(xiàn)相對于安慰劑，安體舒通組患者尿蛋白下降34%，纈沙坦組該數(shù)據(jù)為16.8%，提示醛固酮可獨立引起糖尿病腎臟損傷［11］。故阻斷醛固酮的生物效應可使糖尿病腎臟得到有益的保護作用。安體舒通為酫固酮拮抗劑，研究發(fā)現(xiàn)其可通過降低心臟負荷，改善心臟的舒張功能，改善糖尿病患者的內(nèi)皮功能，而對糖尿病腎組織有保護作用，但對腎小球足細胞Nephrin 的作用還不清楚。

本研究顯示相對于正常大鼠，糖尿病腎病鼠BUN、Ccr、24hUpro 明顯升高，Nephrin 表達下降，差異有顯著性意義。安體舒通干預組腎功能較DN 組好轉，且Nephrin 表達升高，說明其可顯著改善糖尿病大鼠的腎功能。與DN 組相比，血脂蛋白A 下降而腎組織nephrin 蛋白表達水平升高。以上提示安體舒通對腎臟的保護作用可能通過上調(diào)Nephrin 蛋白保護足細胞而實現(xiàn)的。血脂蛋白A 是冠心病獨立的危險因子，免疫組化技術研究發(fā)現(xiàn)血脂蛋白A特異性存在于動脈粥樣斑塊中，參與動脈粥樣硬化的形成。結果顯示，安體舒通可以降低腎小球動脈血管的硬化，這可能也與其保護腎臟組織有關。

Nephrin 蛋白的表達可受到多種因素的影響，血管緊張素或腎臟炎癥信號因子NF -kB 等［12］，而研究表明安體舒通可阻斷醛固酮的作用，可降低其對MAPK 信號通路的激活，阻止腎小球的肥大與纖維化;抗氧化應激，減少ROS 的產(chǎn)生，減少NFkB 等炎癥因子的產(chǎn)生，所以安體舒通可能也是通此途徑上調(diào)Nephrin 蛋白的表達，同時減少腎小球血管硬化，而對糖尿病的腎臟組織有保護作用。

綜上所述，安體舒通在糖尿病腎病早期起積極干預作用，可能和其抗醛固酮、抗氧化應激、降血脂蛋白、促進腎臟Nephrin 蛋白表達有關。而Nephrin蛋白上調(diào)進一步改善足細胞的結構，從而降低腎小球對白蛋白的濾過，降低了蛋白尿水平，減輕腎臟組織損傷，從而改善了腎功能。

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