表皮生長因子在糖尿病足潰瘍創(chuàng)面愈合過程中的作用觀察及其機(jī)制探討

劉如俊，趙文志，張 路，王國強(qiáng)

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 研究生院，遼寧 大連116044;2.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 創(chuàng)傷骨一科，遼寧 大連116027)

全球糖尿病發(fā)病率日益增高，給人類的公共健康帶來了巨大威脅。在發(fā)展中國家，足潰瘍和截肢較為嚴(yán)重，且常合并為廣泛的感染。如何治療糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulcer，DFU)，引起廣泛的關(guān)注，而對糖尿病足潰瘍治療的過程中，難點和焦點就集中在DFU 創(chuàng)面愈合差、創(chuàng)面愈合延遲，甚至久治不愈等。目前，關(guān)于糖尿病足部潰瘍難愈合的機(jī)制尚不清楚，己知與創(chuàng)面細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子、血管因素等有關(guān)。EGF 可以誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞和纖維母細(xì)胞增生、使角質(zhì)層增厚、刺激周圍神經(jīng)再生［1-3］。有研究表明表皮生長因子及其受體相對或絕對減少是糖尿病足潰瘍難愈合的重要原因之一。本研究通過潰瘍面局部應(yīng)用表皮生長因子干預(yù)，觀察其對糖尿病足潰瘍創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材 料

實驗試劑:四氧嘧啶(美國Sigma 公司);高脂飼料(大連醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心);RNAprep Pure Tissue Kit DP431(北京TIANGEN)。

儀器:Nano Drop ND -1000 紫外分光光度儀(美國Nano Drop 公司，TaKaRa 公司提供);凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP BioSpectrum);變性梯度凝膠電泳儀(美國 伯樂);光學(xué)顯微鏡;投射電子顯微鏡(JEM-2000EX日本電子公司);核酸定量分析儀(Thermo);梯度PCR 儀(Thermo);全自動高速離心機(jī)(Thermo)。

實驗對象:大連醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供健康新西蘭大白兔70 只(實驗動物使用許可證:SYXK［遼］2008 -0002)，被選的實驗兔體重大約在2.5 ～3.0 kg，新西蘭實驗兔的性別不受限制。

1.2 建立Ⅱ型糖尿病模型

高脂高糖飼料喂養(yǎng)新西蘭兔2 個月，分別于(第1 天、第4 天、第7 天)禁食6 h 后采用耳緣靜脈注射由無菌生理鹽水配制的2.5%四氧嘧啶50 mg/kg，共3 次，第10 天測空腹血糖＞11.1 mmol/L 入選模型，共有32 只實驗兔符合實驗的納入標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 分組及潰瘍創(chuàng)面治療的實施

入選模型的32 只新西蘭兔隨機(jī)分成2 組，每組16 只實驗用新西蘭兔。在兔子大腿部造創(chuàng)，其標(biāo)準(zhǔn)為:實驗用兔足背部切除10 mm×7 mm 矩形區(qū)域全層皮膚，一組局部創(chuàng)口連續(xù)涂抹表皮生長因子(EGF)，用量從始至終為1 mL，每天1 次，作為A組;另一組為不施加干預(yù)的B 組。實驗過程中條件均衡、固定。

1.4 大體觀察

健康新西蘭大白兔糖尿病足潰瘍造模后第7 和第15 天，各新西蘭大白兔糖尿病足潰瘍面用數(shù)碼相機(jī)拍照。圖像經(jīng)圖像處理軟件PS 處理后分析計算出未愈合面積，依如下公式計算出創(chuàng)面愈合率:糖尿病足潰瘍面愈合率=［(原創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/原創(chuàng)面面積)］。

1.5 Masson 染色觀察

大致過程如下:先用10%的甲醛溶液固定標(biāo)本，標(biāo)本脫水后包埋，石蠟切片脫蠟，足量的自來水沖洗，蒸餾水反復(fù)沖洗5 次，Weigert 蘇木精液染核，10 min 后將標(biāo)本水洗。水洗后用Masson 麗村紅酸性復(fù)紅液浸泡8 min，2%冰醋酸水溶液浸1 min，1%磷鉬酸水溶液分化4 min，苯胺藍(lán)染5 min，0.2%冰醋酸水溶液浸洗2 min，常規(guī)用95%酒精，純酒精，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.6 HE 染色觀察

標(biāo)本放入40 g/L 多聚甲醛溶液中，梯度乙醇脫水，二甲苯透明及浸蠟和包蠟。切下的標(biāo)本展開、烤片、脫蠟，然后脫二甲苯，梯度乙醇脫水，染色后，再次梯度乙醇脫水，完成二甲苯透明后封固，最后蘇木精-伊紅染色。

1.7 電子顯微鏡觀察

組織用0.1 mol/L pH7.4 的二甲砷酸鈉緩沖液配制的2.5%戊二醛在4 ℃固定2 h 在0.1 mol/L pH7.4 的二甲砷酸鈉緩沖液洗3 次，再放入用相同緩沖液配制的1% 鋨酸中固定2 h。標(biāo)本投入到30%、50%、70%的乙醇中，在4 ℃條件下各10 min。然后再投入到80%、90%、95%的丙酮中各10 min，100%的丙酮中2 次，每次10 min。標(biāo)本由100%丙酮中移入裝有混勻包埋劑的膠囊中，在30 ℃下震蕩4 h。然后置于35 ℃、45 ℃、60 ℃溫箱中各24 h，使包埋劑聚合，硬化，由流體變?yōu)榫鶆虻墓腆w。然后再切片機(jī)上切片，用銅網(wǎng)收集所得切片，在電子顯微鏡下觀察。

1.8 RT-PCR 檢測EGF 基因表達(dá)

RT—PCR 總 RNA 提 取 及 逆 轉(zhuǎn) 錄:按 照RNAprep Pure Tissue Kit DP431 試劑盒(北京TIANGEN)、大連TaKaRa 公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒和說明書獲得EGFmRNA 的反轉(zhuǎn)錄DNA。PCR 反應(yīng)條件:95 ℃變性5 min;94 ℃變性40 s，55 ℃退火30 s;72 ℃延伸60 s;重復(fù)變性、退火、延伸，共35 個循環(huán)，充分延伸，72 ℃、10 min，結(jié)束溫度為4 ℃。擴(kuò)增產(chǎn)物分析:取5 微升產(chǎn)物在80V 電壓下經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳40 min，利用凝膠成像系統(tǒng)(UVP)觀察、拍照，并用Gel-Pro analyzer 4.0 軟件進(jìn)行灰度分析(以β - actin 為內(nèi)參進(jìn)行擴(kuò)增。β - actin 及bFGF PCR 引物序列見表1)。

表1 引物序列Tab 1 The sequence of primer

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

樣本統(tǒng)計量采用統(tǒng)計分析軟件SPSS13.0 軟件。對照組與實驗組比較前先對樣本資料做正態(tài)分布檢驗及方差齊性檢驗，符合條件后做成組設(shè)計兩樣本t檢驗，實驗設(shè)計為雙側(cè)t 檢驗，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 創(chuàng)面愈合率

A 組愈合迅速，創(chuàng)面完全上皮覆蓋所需平均天數(shù)為12 d，潰瘍愈合率為78%;B 組愈合緩慢，至20 d 時仍未完全上皮覆蓋，潰瘍愈合率僅為35%。見圖1。

2.2 Masson 染色及HE 染色

各組病理切片觀察結(jié)果:第15 天可見A 組肉芽生長迅速，大量成纖維細(xì)胞聚集成群，輪廓較清晰;細(xì)胞外基質(zhì)豐富，膠原纖維束排列密集而有序，可見大量血管生成，組織分層愈合良好。B 組愈合緩慢，膠原纖維稀疏，組織結(jié)構(gòu)不明顯。見圖2、圖3。

2.3 兩組創(chuàng)面組織電鏡觀察

第15 天A 組大體觀細(xì)胞排列整齊、有序，其中成纖維細(xì)胞數(shù)目明顯較多，形狀完好，體積較大，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富。而且細(xì)胞周圍可見大量膠原纖維整齊有序的排列。B 組成纖維細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞內(nèi)容物少，周圍膠原纖維稀疏，排列混亂。見圖4。

2.4 兩組EGF mRNA 比較

A 組EGFmRNA 灰度相對值大于B 組，差異具有顯著性意義，P ＜0.01。見圖5、表2。

圖1 兩組第15 天創(chuàng)面愈合情況Fig 1 The situation of wound healing after 15 days in two groups

圖2 兩組第15 天Masson 染色觀察創(chuàng)面組織結(jié)構(gòu)(×40)Fig 2 The observation of wound in Masson trichrome staining after 15 days in two groups of wound(×40)

圖3 兩組第15 天HE 染色觀察創(chuàng)面組織結(jié)構(gòu)(×40)Fig 3 The observation of wound in HE trichrome staining after 15 days in two groups of wound(×40)

圖4 兩組第15 天透射電鏡結(jié)果(×15 000)Fig 4 The results of wound observed in electron microscope after 15 days in two groups (×15 000)

圖5 兩組EGFmRNA 灰度對比Fig 5 Two gray contrast EGFmRNA

表2 兩組EGFmRNA 相對灰度比值Tab 2 Ratio of EGFmRNA relative gray in two group

3 討 論

國際糖尿病工作組(WGDF)將糖尿病足病定義為:糖尿病患者踝以下累計全層皮膚的創(chuàng)面，而與這種創(chuàng)面的病程無關(guān)的與局部神經(jīng)異常和下肢遠(yuǎn)端外周血管病變相關(guān)的足部感染、潰瘍和/或深層組織破壞的一種病變［4-5］。

糖尿病足部潰瘍難愈合甚至不愈合的原因及機(jī)理目前仍然不清楚。己知與糖尿病血糖控制不佳、創(chuàng)面細(xì)胞、神經(jīng)末梢脫髓鞘、難治性感染、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子和相應(yīng)受體的相對和絕對缺乏、血管因素等有關(guān)［6］。表皮生長因子(EGF)是促進(jìn)創(chuàng)面?zhèn)谟系闹匾L因子之一，而且是第一個被用來研究創(chuàng)面愈合的生長因子［7］。表皮生長因子(EGF)的研究不斷開展，細(xì)胞培養(yǎng)證實，表皮生長因子有促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂、促進(jìn)糖酵解的功能，更為重要的是對表皮細(xì)胞DNA、RNA 的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄有刺激作用，對蛋白質(zhì)的翻譯合成也有一些刺激作用［8］。EGF 可以誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞和纖維母細(xì)胞增生、使角質(zhì)層增厚、刺激周圍神經(jīng)再生［2-3，6］。EGF 不僅參與細(xì)胞增殖、遷移和分化功能的調(diào)節(jié)，而且是有效的促細(xì)胞分離原［9-11］。表皮生長因子(EGF)對表皮細(xì)胞DNA、RNA 的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄有刺激作用，對蛋白質(zhì)的翻譯合成也有一些具有刺激作用［12］。同時，EGF有明顯的趨向活性，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞向創(chuàng)面部位移動、改善創(chuàng)面微環(huán)境和組織營養(yǎng)狀態(tài);EGF 還能刺激纖維結(jié)合素的產(chǎn)生以及通過增加創(chuàng)面局部成纖維細(xì)胞的數(shù)量來促進(jìn)皮膚的增生［13］。2009年有一項多中心、雙盲實驗。實驗是以安慰劑為對照組，評價了對瓦格納分級為3 ～4 級DFU 患者對局部注射rhEGF的療效，實驗結(jié)果為同因素不同水平的實驗組與安慰劑的對照組比較P ＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義［14］。本實驗光鏡下可見表皮生長因子組肉芽生長迅速，大量成纖維細(xì)胞聚集成群，輪廓較清晰;細(xì)胞外基質(zhì)豐富，膠原纖維束排列密集而有序，可見大量血管生成，組織分層愈合良好。對照組愈合緩慢，膠原纖維稀疏，組織結(jié)構(gòu)不明顯。電鏡下的結(jié)果顯示表皮生長因子組成纖維細(xì)胞體積大，形態(tài)完好，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富。細(xì)胞周圍可見大量膠原纖維，排列整齊、有序。糖尿病對照組成纖維細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞內(nèi)容物少，周圍膠原纖維稀疏，排列混亂。A 組愈合迅速，創(chuàng)面完全上皮覆蓋所需平均天數(shù)為12 d，潰瘍愈合率為78%;B 組愈合緩慢，至20 d 時仍未完全上皮覆蓋，潰瘍愈合率僅為35%。本實驗研究初步表明，表皮生長因子干預(yù)的糖尿病足模型組，肉芽生長迅速、大量成纖維細(xì)胞聚集成群;細(xì)胞外基質(zhì)豐富、膠原纖維束排列密集而有序、可見大量血管生成、組織分層愈合良好，而對照組未見。提示表皮生長因子在糖尿病足潰瘍創(chuàng)面愈合過程中具有積極作用［15-16］。

糖尿病足潰瘍面難愈合的一個重要因素就是糖尿病足創(chuàng)面的組織和細(xì)胞生長因子(GF)及其受體相對或絕對缺乏，實驗證明可以顯著提高潰瘍愈合率的方法之一就是局部運用有活性的生長因子(GF)［9］，例如表皮生長因子，血管內(nèi)皮生長因子，胰島素樣生長因子等。EGF 主要是由血小板、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞所分泌［17］，受體結(jié)合分析表明，大部分細(xì)胞表面都含有EGF 的受體蛋白［18］。血小板、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞分泌的EGF 和表皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞膜相應(yīng)的受體蛋白結(jié)合，主要參與細(xì)胞的增殖、遷移和分化功能的調(diào)節(jié)。實驗已經(jīng)發(fā)現(xiàn)EGF 在臨床上有促進(jìn)創(chuàng)面愈合的效果，但是其作用機(jī)理在分子及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面不是很清楚。本實驗EGFmRNA分析的結(jié)果，A 組EGFmRNA 的灰度相對值為109.31 ±5. 17;B 組EGFmRNA 的灰度相對值為61.59 ±4.61。兩樣本數(shù)據(jù)都符合正態(tài)分布且方差齊性，差異有顯著性意義(P ＜0.01)。實驗初步說明實驗組的內(nèi)源性EGF 的表達(dá)高于對照組內(nèi)源性EGF 的表達(dá)，說明實驗因素是和觀察指標(biāo)(內(nèi)源性EGFmRNA)相關(guān)的?？赡艿脑頌橥庠葱訣GF 可能促進(jìn)了內(nèi)源性EGF 的表達(dá)，其上調(diào)了局部EGF基因的表達(dá)［19-20］。這種假設(shè)需要做進(jìn)一步的單因素多水平的實驗設(shè)計后回歸分析。外源性的表皮生長因子(EGF)可以促進(jìn)EGFmRNA 的轉(zhuǎn)錄和翻譯，EGFmRNA 更好地得到基因表達(dá)，從而刺激組織分泌EGF，分泌的EGF 和表皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞膜相應(yīng)的受體蛋白結(jié)合，主要參與細(xì)胞的增殖、遷移和分化功能的調(diào)節(jié)。完成膠原組織構(gòu)建，加速創(chuàng)面肉芽組織生成和上皮組織的形成，加速創(chuàng)面愈合速度，達(dá)到創(chuàng)面愈合質(zhì)量［14，19-20］。

表皮生長因子在促進(jìn)創(chuàng)面愈合方面已經(jīng)顯示出了積極的作用。但是，此外EGF 的應(yīng)用還有需要解決的問題，比如用藥劑量和方法［21］，創(chuàng)面的評估和如何清創(chuàng)，會不會誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生等。在有效的控制血糖的基礎(chǔ)上，需要客觀的分析，運用“創(chuàng)面床準(zhǔn)備(wound bed preparation，wbp)”理論，對創(chuàng)面的形成時間長短不同、創(chuàng)面大小及潰瘍程度不同、不同階段實施不同的干預(yù)會收到更好的治療效果［22］。外源性EGF 是如何促進(jìn)內(nèi)源性EGF 表達(dá)的，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑需要進(jìn)一步探究。外源性GF 半衰期短，局部使用之后很快被稀釋和降解，需反復(fù)大量使用，且價格昂貴。

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