裸鼠人異位移植胃癌肝轉(zhuǎn)移和腹膜轉(zhuǎn)移模型的實(shí)驗(yàn)研究

劉福全，王 健，趙雪峰

(大連大學(xué) 附屬新華醫(yī)院 胃腸微創(chuàng)外科中心，遼寧 大連116021)

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率占惡性腫瘤的第4 位，腫瘤相關(guān)死亡率的第2 位［1］。胃癌根治術(shù)后最常見的3 種復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移模式為區(qū)域淋巴結(jié)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、腹膜種植轉(zhuǎn)移。肝臟是胃癌血行轉(zhuǎn)移最常見的部位，是胃癌轉(zhuǎn)移的第一靶器官;腹膜又成為胃癌細(xì)胞種植的適宜的“土壤”［2］。胃癌晚期主要發(fā)生肝轉(zhuǎn)移和腹膜種植轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率高達(dá)40% ～50%［3-4］。研究胃癌轉(zhuǎn)移癌的發(fā)生機(jī)理及防治策略，需要可靠而穩(wěn)定的動物模型系統(tǒng)。

胃癌的原位移植模型再現(xiàn)胃癌的大多數(shù)生物學(xué)特性，但轉(zhuǎn)移部位廣泛，缺少系統(tǒng)的以肝或腹膜為主要靶向的轉(zhuǎn)移模型，使其應(yīng)用受到一定的限制。本課題主要將同等數(shù)量不同種類胃癌細(xì)胞株建立裸鼠異位移植胃癌肝轉(zhuǎn)移模型及腹膜轉(zhuǎn)移模型，觀察轉(zhuǎn)移癌的生物學(xué)過程，揭開胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為，為胃癌的基礎(chǔ)與臨床研究提供可靠、實(shí)用的動物模型。

1 材料和方法

1.1 材 料

人胃癌細(xì)胞株MKN-45 和TMK-1(ATCC)由韓國CNU 腫瘤研究所Young -Kyu Park 教授捐贈。BALb/c 品系裸鼠40 只，7 周齡雌性，體重18 ～20 g，由韓國CNU 實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供。

1.2 方 法

1. 2. 1 細(xì)胞培養(yǎng)及懸液制備:人胃癌細(xì)胞株MKN-45 和TMK -1 在37 ℃、5% CO2，含10%小牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)，每2 ～3 天換1 次培養(yǎng)液。培養(yǎng)至80% ～90% 融合時，用0.25%胰酶消化液消化后，1 200 r/min 離心3 min，棄上清液，加無血清RPMI 1640 培養(yǎng)液洗細(xì)胞2 次，顯微鏡下計(jì)數(shù)。制備好的細(xì)胞懸液放冰浴保存，于30 min 內(nèi)進(jìn)行接種。

1.2.2 異位移植胃癌肝轉(zhuǎn)移模型的建立:根據(jù)麻醉預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取5%水合氯醛5 mg/kg 行腹腔內(nèi)麻醉。常規(guī)消毒皮膚，取上腹正中切口約0.5 cm，入腹后小心顯露脾臟，使脾中、下極拉出切口外，將31號針頭從脾臟中央進(jìn)針約5 mm 緩慢注入腫瘤細(xì)胞懸液至脾被膜下，注入5 ×106MKN -45 或TMK -1癌細(xì)胞懸液100 μL?？梢娮⑸洳课黄⒈荒ぐl(fā)白腫脹，拔出針頭同時即用止血小紗布壓迫，輕輕按壓約20 s。10 min 后夾閉、切斷脾臟兩側(cè)血管，完整切除脾臟，送回網(wǎng)膜等附件后，關(guān)腹。建立模型全程應(yīng)防止胰腺和胃及主要血管的損傷，也要防止注射細(xì)胞的滲漏。

1.2.3 異位移植胃癌腹膜轉(zhuǎn)移模型的建立:左手抓住裸鼠使腹部朝上，頭低位約15°，向頭側(cè)搖晃裸鼠使腸管移向膈肌層面。右手常規(guī)消毒腹壁，利用31號針頭選擇左下腹迷路進(jìn)針達(dá)腹腔，挑起針頭確認(rèn)為腹腔后，注入5 ×106MKN-45 或TMK-1 癌細(xì)胞懸液200 μL。拔出針頭同時小紗布壓迫片刻。建立模型全程應(yīng)防止針頭刺入空腔臟器、皮下及腹部肌層。

1.2.4 胃癌肝轉(zhuǎn)移和腹膜轉(zhuǎn)移評分標(biāo)準(zhǔn):肝轉(zhuǎn)移模型評分標(biāo)準(zhǔn)如下:0 為無肝轉(zhuǎn)移;1 為最低限度侵及肝臟，浸潤范圍＜0.5 cm2;2 為輕度侵及肝臟，浸潤范圍0.5 ～1.0 cm2;3 為中度侵及肝臟，浸潤范圍1.0 ～2.0 cm2;4 為重度侵及肝臟，浸潤范圍＞2.0 cm2。腹膜轉(zhuǎn)移模型的評分標(biāo)準(zhǔn)分為有或無。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo):每天常規(guī)觀察記錄裸鼠狀態(tài)，包括飲食、營養(yǎng)、活動量、皮膚及排泄物狀態(tài)。裸鼠出現(xiàn)瀕死前癥狀或觀察期滿3 周或6 周時予以處死。首先解剖觀察腹腔內(nèi)移植瘤情況，包括直徑大小、生長部位，質(zhì)地、顏色變化、播散及侵襲范圍、腹盆腔有無腹水及其性狀、區(qū)域或遠(yuǎn)處淋巴結(jié)腫大或轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移情況等。同時觀察胸腔內(nèi)、顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤情況。所有肉眼可疑部位照相并取材，病灶進(jìn)行計(jì)數(shù)和計(jì)量，取出后充分固定在4%多聚甲醛，行病理學(xué)檢查。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 14.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，兩組統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的差異采用t 檢驗(yàn)，不同種類細(xì)胞間的相關(guān)性分析采用Spearman 等級相關(guān)分析，P ＜0.05 表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同種類胃癌細(xì)胞接種的成瘤效果比較

異位移植轉(zhuǎn)移模型的制模過程無一例死亡，成功率達(dá)100%(40/40)。

MKN-45 胃癌細(xì)胞經(jīng)脾肝轉(zhuǎn)移制模3 周后解剖腹腔，發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移灶突出肝表面，大多分布在肝緣，部分融合，呈灰白色，橢圓形結(jié)節(jié)，質(zhì)硬，肝轉(zhuǎn)移評分為2 ～3，但未發(fā)現(xiàn)周圍淋巴結(jié)腫大，也無血性腹水及腹膜種植轉(zhuǎn)移。制模6 周后，發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移灶累及全肝，融合成片，高低不平結(jié)節(jié)，質(zhì)硬，肝轉(zhuǎn)移評分均為4，區(qū)域淋巴結(jié)腫大或轉(zhuǎn)移(2/5;40%)，血性腹水(1/5;20%)(圖1A -B，表1)。胸腔內(nèi)、顱內(nèi)未見轉(zhuǎn)移灶。TMK -1 胃癌細(xì)胞經(jīng)脾肝轉(zhuǎn)移制模3周后解剖腹腔，發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移灶突出肝表面，但零星可數(shù)，分布在膽囊周圍的肝緣，呈淡白色，不規(guī)則結(jié)節(jié)，質(zhì)中，肝轉(zhuǎn)移評分為1 ～2，未發(fā)現(xiàn)周圍淋巴結(jié)腫大，也無血性腹水及腹膜種植轉(zhuǎn)移。制模6 周后，發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移灶增多，病灶明顯突出于肝表面，未融合，腫物巨大，呈灰白色，略圓形，腫物高低不平，質(zhì)硬，肝轉(zhuǎn)移評分均為4，出現(xiàn)血性腹水(2/5;40%)，但無區(qū)域淋巴結(jié)腫大(圖1C-D，表1)。胸腔內(nèi)、顱內(nèi)未見轉(zhuǎn)移灶。

MKN-45 胃癌細(xì)胞注入腹腔制模3 周后解剖腹腔，發(fā)現(xiàn)腸系膜轉(zhuǎn)移灶清楚可數(shù)(范圍No.19 ～30)，病灶較小，略透明，橢圓形，質(zhì)軟，無血性腹水和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。制模6 周后，發(fā)現(xiàn)腹膜轉(zhuǎn)移灶明顯增多(范圍No.49 ～96)，病灶變大，多侵及高位膽管而形成膽汁淤積、膽汁滲漏，腫物表面呈淡黃色，略圓形，質(zhì)地變硬，出現(xiàn)血性腹水(2/5;40%)，肺等遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移(3/5;60%)(圖1E - F，表2)。TMK -1胃癌細(xì)胞注入腹腔內(nèi)制模3 周后解剖腹腔，發(fā)現(xiàn)腸系膜轉(zhuǎn)移灶部分融合，呈灰白色，不規(guī)則形狀，質(zhì)中，病灶數(shù)少(范圍No.2 ～8)，無血性腹水和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。制模6 周后，發(fā)現(xiàn)腹膜轉(zhuǎn)移灶明顯增多(范圍No.18 ～28)，病灶巨大，與其他臟器分界不清，呈白色，質(zhì)硬，大多與腸系膜血管粘連融合，開始出現(xiàn)血性腹水(2/5;40%)，肺等遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移(2/5;40%)(圖1G-H，表2)。

圖1 接種MKN-45 和TMK-1 胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移瘤照片F(xiàn)ig 1 Photographs of the tumor growth in the metastatic tumors after MKN-45 and TMK-1 gastric cancer cell line inoculation

表1 胃癌肝轉(zhuǎn)移模型成膜比較Tab 1 comparison of liver metastasis model

MKN -45 和TMK -1 胃癌細(xì)胞經(jīng)脾肝轉(zhuǎn)移制模3 周組肝轉(zhuǎn)移評分明顯低于制模6 周組，差異有顯著性意義(分別為P = 0. 005 和P ＜0. 001);MKN-45 和TMK-1 胃癌細(xì)胞注入腹腔制模3 周組腹膜轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)明顯少于制模6 周組(分別為P=0.003和P ＜0.001);兩組模型的不同種類胃癌細(xì)胞株之間的局部和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率無明顯相關(guān)性(r =0.251，P ＞0.05)(表1-2)。

表2 胃癌腹膜轉(zhuǎn)移模型成膜比較Tab 2 comparison of peritoneal metastasis model

2.2 成瘤組織病理學(xué)觀察

接種MKN -45 胃癌細(xì)胞株為例，其成瘤癌細(xì)胞特點(diǎn)為片狀、巢狀或條索狀排列，形態(tài)呈圓形、橢圓形、條索形或不規(guī)則形，細(xì)胞分化程度低，核大，深染，核質(zhì)比大，易見核分裂，浸潤性生長。轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)、肝臟及腹膜的癌細(xì)胞，依次為居中分布在諸多淋巴細(xì)胞周圍、肝血管竇周圍及血管周圍(圖2)。轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞形態(tài)特征與原發(fā)胃癌細(xì)胞相似。

圖2 接種MKN-45 胃癌細(xì)胞株后轉(zhuǎn)移瘤病理切片 (×200)Fig 2 Pathological identification of the metastatic tumors in the lymph node，liver，and peritoneum after MKN-45 gastric cancer cell line inoculation (Original magnification ×200)

3 討 論

腫瘤轉(zhuǎn)移是極其復(fù)雜的過程，包括細(xì)胞外基質(zhì)的降解、細(xì)胞粘附性能改變、腫瘤血管形成、細(xì)胞存活等幾個方面［5］。大多數(shù)腫瘤轉(zhuǎn)移都遵循每個復(fù)雜的轉(zhuǎn)移步驟，但只有少數(shù)具有突破一系列的屏障的潛能而發(fā)生轉(zhuǎn)移。每個轉(zhuǎn)移步驟都涉及多種分子事件，這一分子事件的了解將為腫瘤轉(zhuǎn)移的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。因此，了解胃癌肝轉(zhuǎn)移和腹膜轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制是胃癌診治中的一項(xiàng)重要而迫切的任務(wù)。

建立合理的異位移植胃癌肝轉(zhuǎn)移及腹膜轉(zhuǎn)移模型是研究胃癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的基礎(chǔ)。目前對原位移植和異位移植模型的制作有一定的分歧，趨向于原位移植轉(zhuǎn)移法比異位移植轉(zhuǎn)移法更好地完成并再現(xiàn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的惡性生物學(xué)行為過程。原位移植模型，雖然有腫瘤原位生長、又有區(qū)域淋巴結(jié)腫大及轉(zhuǎn)移癌形成等優(yōu)點(diǎn)，但腹腔內(nèi)區(qū)域淋巴結(jié)及腹腔轉(zhuǎn)移灶區(qū)分困難，也不利于實(shí)驗(yàn)觀察和抗轉(zhuǎn)移治療的處理，更不便于胃癌單純肝轉(zhuǎn)移或腹膜轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究［6］。為此，本組將不同種類癌細(xì)胞為媒介制作異位移植模型，判斷其模型可否值得前臨床推廣。本實(shí)驗(yàn)研究的優(yōu)勢在于:(1)同等數(shù)量不同種類癌細(xì)胞株建立的異位移植模型，并同等條件下觀察模型的成瘤變化，成功再現(xiàn)同種類又不同分化程度癌腫的浸潤和轉(zhuǎn)移能力;(2)癌細(xì)胞與Matrigel 的混勻注入，可使癌細(xì)胞游動空間局限而成模穩(wěn)定，也有防止術(shù)中滲漏的功效;(3)經(jīng)脾注入癌細(xì)胞數(shù)分鐘后切除脾臟的方法，不僅能將癌細(xì)胞充分游移至肝臟并粘附于肝臟，且減少了其他影響因素，更適合單純性胃癌肝轉(zhuǎn)移的研究;(4)腹膜轉(zhuǎn)移模型未進(jìn)行腹腔內(nèi)麻醉，使得癌細(xì)胞在腹腔內(nèi)的成活率倍增，加上操作完成后裸鼠方可立即活動，增加了癌細(xì)胞在腹腔內(nèi)的擴(kuò)散和移動。(5)所有操作簡便易行，且成瘤率達(dá)100%，能滿足量化實(shí)驗(yàn)，值得臨床推廣應(yīng)用。但其弱勢在于使用了癌細(xì)胞株，產(chǎn)生的腫瘤無法形成原有的腺管樣改變。

原位移植模型的預(yù)制模過程中，發(fā)現(xiàn)制模6 周后才開始出現(xiàn)區(qū)域淋巴結(jié)及腹膜種植轉(zhuǎn)移。由于胃壁注射層面控制困難等諸多因素的制約，模型制作后成瘤相差懸殊，且制模時易控的漿膜下的腫物極易破潰，并肉眼很難辨認(rèn)結(jié)節(jié)的來源。因此不適于腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究模型。本研究主推的異位移植肝轉(zhuǎn)移模型中易見，制模3 周的肝轉(zhuǎn)移評分為≤3，無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腹膜種植轉(zhuǎn)移;制模6 周的肝轉(zhuǎn)移評分均為4，開始出現(xiàn)區(qū)域淋巴結(jié)腫大或轉(zhuǎn)移，但無腹膜種植轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。說明此模型可謂良好的肝轉(zhuǎn)移專一模型。異位移植腹膜轉(zhuǎn)移模型中也不難發(fā)現(xiàn)，制模3 周時無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移跡象;但制模6 周時開始出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移。此模型彌補(bǔ)了單純轉(zhuǎn)移模型不符合多臟器轉(zhuǎn)移研究的空白，也可謂良好的腹膜轉(zhuǎn)移或腹膜轉(zhuǎn)移+肺轉(zhuǎn)移研究模型。

由于各種條件的限制只能觀察制模3 周或6 周后處死的裸鼠，不能以1 周為單量策劃詳細(xì)、周密、系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)。因此購進(jìn)小動物專用IVIS、SPECT/CT、PET/CT 等分子影像學(xué)設(shè)備是滿足前臨床實(shí)驗(yàn)研究與科技同步高速發(fā)展的需求，也彌補(bǔ)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)越來越滿足不了飛速發(fā)展的臨床醫(yī)學(xué)的需求［7-8］。

綜合評價本研究的結(jié)果:異位移植模型是研究胃癌轉(zhuǎn)移規(guī)律及防治措施的可取模型。組織病理學(xué)研究結(jié)果也表明，異位移植模型較好地體現(xiàn)出胃癌轉(zhuǎn)移的基本生物學(xué)特點(diǎn)，包括胃周淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝臟轉(zhuǎn)移及腹膜轉(zhuǎn)移。該模型符合區(qū)域或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為研究，值得推廣應(yīng)用。

特此，感謝韓國Young Kyu Park 教授的捐贈。

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