大鼠乳鼠成骨細胞建立及其生物學(xué)活性的研究

易東升，林 琳，高 峰

(1.大連市第二人民醫(yī)院 骨外科，遼寧 大連116001;2.大連醫(yī)科大學(xué)，遼寧 大連116044 )

1965年，Urist［1］將動物脫鈣的骨基質(zhì)種植于動物肌袋內(nèi)，發(fā)現(xiàn)種植部位有大量軟骨和骨組織生成，并發(fā)現(xiàn)其中一種具有誘導(dǎo)間充質(zhì)細胞向成骨細胞分化成骨的蛋白，此后這種蛋白被命名為骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)。目前，通過基因重組的方法已獲得20 余種BMPs，這些BMPs均能誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞向成骨細胞及軟骨細胞分化，對成骨細胞及其他骨組織工程種子細胞也有同樣的誘導(dǎo)作用，其中BMP -2 和BMP -7 是研究最廣泛，誘導(dǎo)成骨活性最強的兩種BMPs，這兩種BMPs在骨發(fā)生、誘導(dǎo)、修復(fù)和骨量保持方面發(fā)揮著重要而關(guān)鍵的作用。但是，在BMPs 的實驗研究中最多見的是關(guān)于單獨應(yīng)用BMP-2 和BMP -7 對成骨細胞生物學(xué)活性影響的報道，而聯(lián)合應(yīng)用BMP -2 和BMP-7 對成骨細胞生物學(xué)活性影響未見報道。本實驗對制備的大鼠乳鼠成骨細胞，聯(lián)合應(yīng)用BMP -2 和BMP-7，探討聯(lián)合應(yīng)用后對大鼠乳鼠成骨細胞生物學(xué)活性影響，以便進一步為臨床上治療骨缺損，骨折不愈合，促進骨折愈合和椎體融合提供理想的移植細胞。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及主要試劑儀器

出生5日齡的SD 大鼠4 只(雌雄不限):由大連醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，許可證號:SCXK(遼)2008 -0002;胎牛血清:杭州四季清生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;胰蛋白酶、MTT:上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品;倒置相差顯微鏡:重慶光學(xué)儀器廠;CO2孵育箱:英國Thermo 公司;BMP -2 和BMP-7(Rehovot Science Park);堿性磷酸酶測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);骨鈣素放射免疫分析藥盒(北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司);MTT細胞增殖檢測試劑盒(凱基生物科技發(fā)展有限公司);12 孔，24 孔培養(yǎng)板，25 cm2培養(yǎng)瓶(Nunc 公司);二甲基亞颯(天津登峰化學(xué)試劑廠);酶聯(lián)免疫檢測儀(MRX-II 型，美國Dynex 公司);CO2孵育箱(英國Thermo 公司)。

1.2 原代成骨細胞培養(yǎng)方法

1.2.1 成骨細胞的分離培養(yǎng):將5日齡的SD 乳鼠4 只放入750 mL/L 乙醇中浸泡10 min，無菌取顱蓋骨，置于含PBS 液的培養(yǎng)皿中，盡量剔除附著的血管及結(jié)締組織，加入適量2.5 g/L 的胰蛋白酶，于37 ℃氣浴振蕩，預(yù)消化20 min，終止消化，PBS 液清洗。再將顱蓋骨剪成1 mm ×1 mm 碎塊，加入適量1.0 g/L 的Ⅱ型膠原酶，37 ℃氣浴振蕩消化1 h，終止消化，液體移入另一離心管，1 500 r/min 離心10 min，棄去上清液，沉淀即為成骨細胞。用含100 mL/L 胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)液重懸，吹打均勻，接種至培養(yǎng)瓶，37 ℃50 mL/L CO2飽和濕度下培養(yǎng)24 h 后換液，以后每3 d 換液1 次，待細胞長滿后，用2.5 g/L 的胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 成骨細胞的傳代:吸掉以前的培養(yǎng)液;用PBS 液洗滌細胞1 ～2 次;加入胰酶溶液(1 mL/25 cm2、2 mL/75cm2)37 ℃作用數(shù)分鐘，于倒置相差顯微鏡下觀察，當細胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時，吸掉胰酶溶液;輕拍培養(yǎng)瓶使細胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，以吸管上下吸放數(shù)次以打散細胞團塊?；旌暇鶆蚝?，依稀釋比例(1∶2)轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)，以每孔9 ×104接種到預(yù)先放有無菌蓋玻片的24 孔培養(yǎng)板，并以每孔4.8 ×103接種到96 孔培養(yǎng)板中。

1.2.3 活細胞的觀察檢測:臺盼藍染色測細胞成活率:取1 滴5 g/L 的臺盼藍染液(取0.5 g 臺盼藍充分溶于50 mL 的雙蒸水中，濾紙過濾，再加入18 g/L的NaCl 溶液至100 mL)與9 滴細胞懸液混合后，滴入細胞計數(shù)板，靜置2 min 后，在顯微鏡下計數(shù)200個細胞，重復(fù)2 次，未著色的為活細胞，呈藍色的為死細胞，計算活細胞的百分率。

倒置相差顯微鏡觀察:原代培養(yǎng)至細胞匯合后傳代，進行觀察拍片。

噻唑藍(MTT)法檢測細胞活力:在測定前4 h取出1 塊96 孔板，更換成無血清的α -MEM 培養(yǎng)液100 μL(含10 μL 5 g/L 的MTT)，培養(yǎng)箱孵育4 h，加100 μL 無水乙醇，振蕩10 min，在酶標儀上讀取D490nm 值，繪制生長曲線。

1.3 分組及各組處理方法

采用本實驗制備和培養(yǎng)的大鼠乳鼠成骨細胞，以下實驗中所用的細胞均為第3 ～5 代細胞。傳代細胞的培養(yǎng)板孔中加有消毒蓋玻片，制備細胞爬片。將傳代細胞(3 ～5 代)按6.0 ×104/mL 接種于96 孔培養(yǎng)板，100 μL/孔，培養(yǎng)24 h 后，棄去培養(yǎng)液。并將其分為單獨應(yīng)用BMP -2 組和單獨應(yīng)用BMP -7組，聯(lián)合應(yīng)用BMP-2 和BMP-7 組，對照組不加任何處理因素(每組3 孔)，48 h 后，加入15 μL 5.0g/LMTT(新鮮配制)，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄培養(yǎng)液，每孔加150 μL 的二甲基亞砜，振蕩，室溫10 min，570 nm 下測定A 值。

取生長良好的培養(yǎng)細胞，用胰酶消化，計數(shù)，按2.0 ×104/mL 接種于24 孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h 后，棄去培養(yǎng)液及未貼壁細胞，加入用無血清的α -MEM稀釋的BMP(單獨應(yīng)用BMP-2 和BMP -7，聯(lián)合應(yīng)用BMP-2 和BMP -7)，對照組僅加培養(yǎng)液。48 h后收集細胞裂解液，檢測ALP 活性，OCN 含量和總蛋白含量(每組3 孔)。細胞裂解液中總蛋白含量測定用Pierce 公司的BCA(Bicinchininic acid)試劑盒，按試劑說明進行測定。

1.4 測定方法

1.4.1 細胞裂解液(加入TritonX -100 過夜)中堿性磷酸酶活性測定:采用磷酸對硝基苯醋二鈉鹽為底物，405 nm 波長比色，測定吸光度值，換算成國際單位，以IU/L·mg 蛋白表示ALP 活性，蛋白含量的測定用BCA 法(Pierce 公司試劑盒)。

1.4.2 OCN 含量檢測:OCN 含量檢測用放射免疫法(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科)，用ng/L·mg 蛋白表示細胞裂解液中OCN 含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件，多組樣本均數(shù)比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用q 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細胞成活率

膠原酶消化的原代細胞成活率88.69%;待細胞長滿后用胰酶消化傳代的細胞成活率94.12%。

2.2 MTT 法繪制生長曲線

用MTT 法檢測細胞活力的結(jié)果顯示，成骨細胞在接種后第4 ～5 天進入對數(shù)生長期，第10 天達到生長峰值，此后進入生長衰減期(見圖1)。

圖1 成骨細胞的生長曲線Fig 1 The growth curve of osteoblasts

2.3 原代及傳代培養(yǎng)成骨細胞的生物學(xué)特征

用膠原酶消化下來的成骨細胞接種培養(yǎng)12 h后，倒置顯微鏡下可見貼壁生長的細胞呈現(xiàn)成纖維細胞樣外觀，為不規(guī)則梭形，三角形或多角形，有較多突起，部分細長突起?？缭郊毎c遠處的細胞突起相連接，胞核呈圓形或橢圓形，居中或偏于一側(cè)，輪廓清晰，可見1 ～3 個核仁(圖2A)。細胞長滿瓶壁時，細胞多呈梭形或立方形，排列緊密。繼續(xù)進行傳代，以每孔9 ×104接種到24 孔培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞大部分匯合后，換成成骨細胞誘導(dǎo)液，培養(yǎng)至第6 天細胞重疊生長，開始形成細胞團塊，第10 天可見鈣化結(jié)節(jié)形成，第17 天可見多個鈣化結(jié)節(jié)融合在一起。

2.4 ALP 染色的光鏡觀察

用NBT/BCIP 染色試劑盒染色的結(jié)果顯示，成骨細胞呈藍色，且顏色深淺不等，功能活躍細胞著色較深，功能不活躍的細胞著色較淺(圖2B)。Gomori改良鈣-鈷法染色的結(jié)果顯示，成骨細胞胞質(zhì)內(nèi)有灰黑色顆?；驂K狀沉淀(圖2C)。且ALP 染色陽性率為98.06%。

2.5 礦化結(jié)節(jié)的光鏡觀察

用倒置相差顯微鏡觀察成骨細胞，可見多個大小不等的礦化結(jié)節(jié)(圖2D)，茜素紅染色時礦化結(jié)節(jié)紅染，有的多個礦化結(jié)節(jié)融合(圖2E)，四環(huán)素標記后用熒光顯微鏡觀察，礦化結(jié)節(jié)呈綠色(圖2F)。

2.6 BMP 對成骨細胞增殖和分化的影響

聯(lián)合應(yīng)用BMP-2 和BMP-7，單獨應(yīng)用BMP-2 和BMP-7，不應(yīng)用BMP-2 和BMP -7(對照組)處理成骨細胞48 h 后，成骨細胞增殖(MTT 法)，ALP 活性和OCN 含量檢測結(jié)果見表1。

結(jié)果顯示，單獨應(yīng)用BMP -2 和BMP -7，48 h后，均能刺激大鼠乳鼠成骨細胞的增殖，增加成骨細胞ALP 活性和OCN 含量，但與對照組比較差異無顯著性意義(P ＞0.05)。但聯(lián)合應(yīng)用BMP-2 和BMP-7 后對大鼠乳鼠成骨細胞的增殖，增加成骨細胞ALP活性和OCN 含量較對照組，單獨應(yīng)用BMP -2 和BMP-7 組比較差異有顯著性意義(P ＜0.05)。

3 討 論

BMP(bone morphogenetic protein)最早定義為在骨骼外的部位能誘導(dǎo)骨形成的蛋白質(zhì)［2］，它屬于轉(zhuǎn)移生長因子- β(transforming growth factor - β，TGF-β)超家族成員?，F(xiàn)己發(fā)現(xiàn)有20 多種BMPs，在形態(tài)發(fā)生和胚胎形成的過程中BMPs 影響骨、軟骨及骨骼的形成［2-3］。

圖2 貼壁生長的成骨細胞及鑒定觀察Fig 2 Identification observe about the growth of osteoblasts

表1 BMP 對成骨細胞增殖和分化的影響Tab 1 BMP effects on osteoblast proliferation and differentiation ( ± s)

表1 BMP 對成骨細胞增殖和分化的影響Tab 1 BMP effects on osteoblast proliferation and differentiation ( ± s)

1)與對照組、BMP-2 組和BMP-7 組比較，P ＜0.05

組別 MTT(A 值) ALP/TP(IU/L·mg 蛋白) OCN/TP(ng/L·mg 蛋白)對照組0.337 ±0.004 0.350 ±0.087 7.077 ±0.472 BMP-2 組 0.369 ±0.006 0.400 ±0.044 9.330 ±1.211 BMP-7 組 0.447 ±0.005 1.203 ±0.293 9.410 ±2.104聯(lián)合應(yīng)用組 0.750 ±0.0031) 1.301 ±0.0231) 10.417 ±2.2201)

BMP-2 作為TGF-β 超家族成員，具有很強的促進成骨的功能。有研究報道了BMP-2 對人未成熟成骨細胞前體細胞——新生兒顱骨細胞(human neonetal calvariacells，HNC)的短期(48 h)和長期(3周)作用，發(fā)現(xiàn)BMP-2(0.1 ～100 ng/mL)無論在短期還是長期的培養(yǎng)中都抑制HNC 細胞的增殖，48 h時，ALP 活性明顯增加，但OCN 含量并無明顯變化。3 周時，ALP 活性，OCN 含量，鈣沉積都明顯增加［4］。本實驗的細胞模型來源于大鼠乳鼠顱骨的成骨細胞，BMP-2 作用48 h 后，成骨細胞的增殖，成骨細胞ALP 活性和OCN 含量都有所增加，但與對照組比較差異無顯著性意義。本研究中并未涉及到BMP-2 對成人成骨細胞的長期作用，但目前的結(jié)果至少可以說明來源于新生兒顱骨的成骨細胞和來源于大鼠乳鼠顱骨的成骨細胞對BMP-2 的反應(yīng)并不一致，后者BMP-2 作用48 h 后，OCN 含量已明顯增加，而前者并無明顯變化，提示兩者可能在分化程度上不同。

骨形成蛋白-7(bone morphogenetic protein-7，BMP-7)具有較強的骨誘導(dǎo)能力，是骨形成蛋白家族中誘導(dǎo)成骨能力最強的生長因子之一。BMP -7分布范圍極其廣泛，主要存在于骨，體外實驗為在體實驗提供了佐證與理論支持。Gu 等［5］在鼠成肌細胞的前體細胞C2C12 培養(yǎng)液中添加BMP -7，結(jié)果可引起該細胞由成肌細胞分化途徑轉(zhuǎn)變?yōu)槌晒羌毎緩?。當BMP-7 濃度在200 μg/L 時，可完全抑制肌小管形成并強烈誘導(dǎo)堿性磷酸酶(ALP)活性，與未處理的對照組相比其ALP 活性升高20 倍。骨特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子Runx2/Cbfa1 是成骨細胞分化的分子開關(guān)，其mRNA 水平在BMP-7 處理24 h 達到高峰，升高達6 倍。另外，BMP -7 還可使骨鈣素mRNA 水平升高55 倍，本實驗中BMP -7 雖然對成骨細胞的增殖，成骨細胞ALP 活性和OCN 含量有所增加，但同單獨使用BMP-2 效果一致。

ALP 是成骨細胞分化的早期指標，其表達隨著細胞分化的發(fā)展而增強，其作用是水解有機磷酸釋放出無機磷而用于羥磷灰石的形成，是骨形成所必需的酶，它的表達代表著骨形成的狀況［6］。ALP 的表達緊接著細胞增殖的下調(diào)，代表著細胞分化的開始［7］。骨鈣素作為成骨細胞分化的中期指標，有學(xué)者認為，骨鈣素在維持正常礦化率和抑制軟骨的礦化中起作用［8］，當骨形成和骨吸收解偶聯(lián)時，骨鈣素是反映骨形成的特異指標，而這3 項指標(細胞的增殖，ALP 活性，骨鈣素含量)是檢測成骨細胞生物學(xué)活性的標志性指標。研究結(jié)果表明，聯(lián)合應(yīng)用BMP-2 和BMP-7 作用大鼠乳鼠成骨細胞，成骨細胞的增殖MTT(A值)，成骨細胞ALP 活性，骨鈣素含量都較對照組，BMP-2 組，BMP -7 組有了明顯的增加(P ＜0.05)。結(jié)果可能與BMP 的生物學(xué)活性有關(guān)，BMP 本身就有誘導(dǎo)成骨細胞形成的作用。而其更重要的意義在于:BMP 在骨的發(fā)生與修復(fù)過程中具有重要作用，因而BMP 在骨科的疾病治療中具有十分廣闊的應(yīng)用前景，BMP 具有治療大塊骨缺損以及骨不連的功能。除治療骨缺損和骨不連外，臨床上將BMP 用于脊柱融合也取得了很好的療效，Cook SD 等［9］將BMP 作為骨移植的替代物用于椎體融合，結(jié)果顯示融合效果良好，且與自體骨移植相比，融合速度更快，融合后脊柱的生物力學(xué)穩(wěn)定性更佳。

聯(lián)合應(yīng)用BMP -2 和BMP -7 刺激成骨細胞后，使成骨細胞生物學(xué)活性得到顯著增強，使得聯(lián)合應(yīng)用BMP-2 和BMP-7 對骨組織工程學(xué)以及臨床上治療骨缺損，骨折不愈合，促進骨折愈合和脊柱融合提供了依據(jù)。

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