粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)高脂喂養(yǎng)兔動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響及機(jī)制初探

胡朝暉，馬曉萍，李元民，李 磊，劉如輝，徐文俊，楊 茗，蔣金法.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院心內(nèi)科，上海 00065；.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院眼科，上海 000；.泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，泰安 7000

·論著·

粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)高脂喂養(yǎng)兔動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響及機(jī)制初探

胡朝暉1，馬曉萍2，李元民3，李 磊2，劉如輝1，徐文俊1，楊 茗2，蔣金法1
1.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200065；
2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院眼科，上海 200032；
3.泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，泰安 271000

目的觀察粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討，為臨床提供參考。方法將30只新西蘭雄性健康大白兔隨機(jī)分為對(duì)照組6只，高脂喂養(yǎng)組、普通及高脂喂養(yǎng)＋G-CSF組各8只，4組動(dòng)物每周采血，監(jiān)測(cè)總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）等各項(xiàng)血脂指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化。取材后用蘇丹Ⅲ染色觀察脂肪斑塊面積，蘇木精-伊紅（HE）染色觀察內(nèi)膜厚度等形態(tài)學(xué)變化。免疫組化觀察基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）9及其抑制物（TIMP-2）的表達(dá)。并用Leica QwinV3圖像分析系統(tǒng)計(jì)算陽(yáng)性率等相關(guān)指標(biāo)。掃描電鏡觀察內(nèi)皮及脂肪細(xì)胞的組間差異。結(jié)果高脂喂養(yǎng)能使TC、LDL等血脂水平上升，6周后高峰，與對(duì)照相比，P＜0.05，但8周后就趨于穩(wěn)定。加G-CSF使血脂高峰前移，使TC、LDL等提前2周就與對(duì)照組出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)差異(P＜0.05)，并有雙峰樣改變，但對(duì)TG同樣無(wú)影響。普通喂養(yǎng)＋G-CSF能使血脂有所波動(dòng)，但尚不足以達(dá)到顯著差異。病理分析發(fā)現(xiàn)G-CSF能使斑塊面積、內(nèi)膜厚度、MMP/TIMP表達(dá)均增加，但后二者并未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。掃描電鏡支持上述發(fā)現(xiàn)。結(jié)論 G-CSF對(duì)血脂存在一定影響，且以TC、LDL為主，對(duì)TG作用不大。因此它可使動(dòng)脈粥樣硬化惡化，具體表現(xiàn)為斑塊面積的擴(kuò)大，內(nèi)膜厚度增加，機(jī)制可能與其對(duì)基質(zhì)的影響有關(guān)，但尚需進(jìn)步研究證實(shí)。

動(dòng)脈粥樣硬化；高脂喂養(yǎng)；粒細(xì)胞集落刺激因子；兔

粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）是廣泛應(yīng)用于放療和化療患者動(dòng)員干祖細(xì)胞支持造血恢復(fù)的細(xì)胞因子，近來(lái)研究表明，在心肌梗死后用G-CSF可動(dòng)員骨髓干細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)，遷移到心肌梗死部位而促使心肌再生和血管新生，而改善心臟功能[1]。目前，G-CSF治療心肌梗死的實(shí)驗(yàn)性研究已很多，并進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。但由于具體機(jī)制不明，對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化，G-CSF具備怎樣的影響，國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)界尚無(wú)定論。因?yàn)榇蠖鄶?shù)心肌梗死患者均存在程度不同的動(dòng)脈粥樣硬化，所以系統(tǒng)地研究G-CSF在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用，以求最大效能地發(fā)揮其良好效應(yīng)，防止不良作用，這具有很大的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

重組G-CSF購(gòu)自上海三維生物技術(shù)有限公司；日立7170全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)總膽固醇三酰（TC）、甘油（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）等指標(biāo)；常規(guī)病理分析及免疫組化在上海市心血管病研究所病理實(shí)驗(yàn)室完成；基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)抗體購(gòu)自密理博公司(CHEMICON MAB3309)，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物2(TIMP-2)抗體購(gòu)自Thermo公司(Clone3A4)，免疫組化SABC試劑盒購(gòu)自上海晶美生物公司；電鏡標(biāo)本制作及掃描觀察在復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院電鏡室完成。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物及分組

30只體質(zhì)量為2.0～2.5 kg的雄性新西蘭大白兔，隨機(jī)抽取24只等分為3組：普通喂養(yǎng)＋G-CSF組、高脂喂養(yǎng)組、高脂喂養(yǎng)＋G-CSF組，按文獻(xiàn)嚴(yán)格配制高脂飼料喂養(yǎng)[2]。另6只設(shè)為對(duì)照組，普通喂養(yǎng)，僅在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)采血標(biāo)本及取材做對(duì)照。

1.2.2 給藥

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，對(duì)照及高脂喂養(yǎng)組用0.5 ml生理鹽水，普通及高脂喂養(yǎng)＋G-CSF組予以10 μg/kg G-CSF用生理鹽水稀釋成0.5 ml，每日皮下注射，連續(xù)5日，隔周進(jìn)行。共4次。

1.2.3 血脂測(cè)定

每周測(cè)量4組（血漿TC、TG、LDL、HDL）。采用公式計(jì)算動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)（AI）=(TC－HDL)/ HDL[3]。

1.2.4 病理分析

10周后處死動(dòng)物取材，以病變可能最嚴(yán)重的胸主動(dòng)脈為主要研究對(duì)象：（1）蘇丹Ⅲ脂肪染色：取下約2 cm胸主動(dòng)脈，常規(guī)10%中性甲醛固定及染色處理后，用大頭針展平在平面上數(shù)碼拍照，應(yīng)用leica Qwin V3圖片分析系統(tǒng)（色差標(biāo)記二進(jìn)制編輯法）計(jì)算動(dòng)脈脂肪斑塊面積比；（2）常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色：同樣部位組織取約0.7 cm石蠟包埋，切片染色后，顯微鏡下觀察管腔形態(tài)變化，同樣用上述系統(tǒng)測(cè)量距離，分析內(nèi)膜厚度及其占管腔比；（3）免疫組化：采用SP法，DAB顯色，上述圖像分析系統(tǒng)計(jì)算MMP9及TIMP2陽(yáng)性率。

1.2.5 掃描電鏡觀察

在4組相同部位取下胸主動(dòng)脈組織，迅速生理鹽水漂洗，鋪平，用鋒利刀片制作成0.5 mm2平面盡快置入戊二醛電鏡固定液送檢，處理后掃描觀察標(biāo)本的內(nèi)皮細(xì)胞及泡沫細(xì)胞、脂肪斑塊的形態(tài)變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)期間8只兔子死亡：對(duì)照組1只、高脂喂養(yǎng)組2只、高脂喂養(yǎng)＋G-CSF組3只，普通喂養(yǎng)＋GCSF組2只，最終各組分別存活有5、6、5、6只動(dòng)物，達(dá)到完成實(shí)驗(yàn)要求。

2.1 血脂及動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)的動(dòng)態(tài)變化

分析發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中各項(xiàng)血脂指標(biāo)以TC、LDL、HDL上升為主，TG基本不受影響。高脂喂養(yǎng)＋G-CSF組上升更快（圖1），第3周始TC、LDL與對(duì)照組相比達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，第4周動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)、HDL與對(duì)照組相比也開(kāi)始有顯著差異（P＜0.05），見(jiàn)表1。而高脂喂養(yǎng)組則上升較為平緩，第6周開(kāi)始才有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其中高脂喂養(yǎng)＋G-CSF組出現(xiàn)2個(gè)高峰；但高脂喂養(yǎng)組血脂水平均為7周達(dá)到最高峰，8周后逐步進(jìn)入穩(wěn)定期，見(jiàn)表2。雖然高脂喂養(yǎng)＋G-CSF組TC、LDL等指標(biāo)均高于高脂喂養(yǎng)組，但此2組間相比并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），這可能與樣本量減少有關(guān)。而普通喂養(yǎng)＋G-CSF雖然使各項(xiàng)血脂水平有所波動(dòng)，尤其在4周似顯上升，但與對(duì)照相比，并無(wú)統(tǒng)計(jì)差異。而對(duì)照組各血脂水平基本平穩(wěn)，無(wú)顯著變化。

圖1 各組血脂動(dòng)態(tài)變化折線圖Fig.1 The dynamic change of blood lipid in 4 groups

表1 斑塊面積、內(nèi)膜厚度、MMP-9/TIMP-2陽(yáng)性率的對(duì)比Tab.1 The contrast of plaque area，thickness of intima，positive rate of MMP-9 and TIMP-2

表2 4組不同時(shí)間點(diǎn)動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)的變化Tab.2 The changes of atherosclerosis index during different time in 4 groups

2.2 病理分析

高脂喂養(yǎng)2月后，兔胸主動(dòng)脈均可形成明顯的動(dòng)脈粥樣硬化脂肪斑塊，與對(duì)照組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。其中高脂喂養(yǎng)＋G-CSF組更為顯著，且與高脂喂養(yǎng)組也達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。二者的內(nèi)膜厚度也較正常對(duì)照相比明顯增厚，其中高脂喂養(yǎng)＋G-CSF組達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。MMP-9及TIMP-2在正常血管組織中均很少表達(dá)，隨著動(dòng)脈粥樣硬化的形成，兩者表達(dá)量上升，以高脂喂養(yǎng)＋G-CSF組更明顯，并出現(xiàn)比例的失調(diào)。但高脂喂養(yǎng)＋G-CSF組與高脂喂養(yǎng)組之間差異并未達(dá)到顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。但即使普通喂養(yǎng)，加用G-CSF能使內(nèi)膜增厚，MMP9及TIMP2的

表達(dá)均升高，與對(duì)照相比，后者達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），病理標(biāo)本見(jiàn)圖2～圖5。

2.3 掃描電鏡觀察胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞及脂肪斑塊

掃描電鏡鏡下可見(jiàn)對(duì)照組動(dòng)脈表面基本光滑，內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，分布平整，無(wú)明顯脂肪浸潤(rùn)跡象。加G-CSF后內(nèi)膜略顯增厚，表面粗糙，凹凸不平，但未見(jiàn)明顯斑塊及脂滴。而高脂喂養(yǎng)后內(nèi)膜變得粗糙，內(nèi)皮細(xì)胞變形，出現(xiàn)脂滴樣變化，并有少量凋亡，可見(jiàn)細(xì)胞碎片。加用G-CSF后病變更加顯著，內(nèi)膜表面凹凸不平，出現(xiàn)大塊斑塊，內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)纏繞、扭曲，大片細(xì)胞死亡，組織碎片雜亂無(wú)章（圖6）。

圖2 胸主動(dòng)脈（蘇丹Ⅲ染色×200）Fig.2 SudaneseⅢfat dye of aorta thoracicalis（×200）

圖3 胸主動(dòng)脈（HE染色×200）Fig.3 HE staining of aorta thoracicalis（×200）

圖4 MMP9免疫組化Fig.4 IHC of MMP-9

圖5 TIMP2免疫組化Fig.5 IHC of TIMP-2

圖6 胸主動(dòng)脈掃描電鏡（×500）Fig.6 Scanning electron microscope of aorta thoracicalis（×500）

3 討論

近年來(lái)，隨著干細(xì)胞移植治療心肌梗死等相關(guān)研究的逐步深入，人們發(fā)現(xiàn)單用干細(xì)胞動(dòng)員劑如G-CSF也能達(dá)到類似療效。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)G-CSF不僅對(duì)急性心肌梗死具良好的治療作用，對(duì)于慢性缺血性心臟病也能起到很好的心臟保護(hù)效應(yīng)[4]?？梢韵胂螅磥?lái)G-CSF在心血管領(lǐng)域必然得到更加廣泛的應(yīng)用。但其畢竟是具備多種效應(yīng)的細(xì)胞因子，除導(dǎo)致白細(xì)胞增多、引起高黏滯血癥外，還對(duì)凝血、抗凝血系統(tǒng)有較大影響，引起高凝狀態(tài)。這一作用可能與G-CSF引起的應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)[5]。如有學(xué)者在急性或陳舊性心肌梗死患者皮下注射G-CSF 4 d后行PCI治療，支架內(nèi)再狹窄率明顯增高，不得不中斷試驗(yàn)[6]。由此我們必須注意到，GCSF作用于心臟的同時(shí)，必然對(duì)全身循環(huán)系統(tǒng)產(chǎn)生作用，尤其是與心血管疾病密切相關(guān)的動(dòng)脈。而絕大多數(shù)缺血性心臟病患者，往往伴隨動(dòng)脈粥樣硬化，這不得不引起警惕。

G-CSF對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的作用，由于具體機(jī)制不明，爭(zhēng)議很多。Hasegawa等[7]研究了兩種兔的動(dòng)脈粥樣硬化模型(自發(fā)型及球囊擴(kuò)張后誘發(fā)型)，并分別給予G-CSF處理，對(duì)照組給予生理鹽水，結(jié)果顯示G-CSF明顯促進(jìn)了損傷血管的再內(nèi)皮化，阻止了新生內(nèi)膜與中膜比率的增加。這說(shuō)明G-CSF對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化具有治療潛力。但是，Haghighat等[8]對(duì)ApoE基因敲除小鼠進(jìn)行研究，分別給予G-CSF及GM-CSF處理，對(duì)照組給予NS，結(jié)果發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化反而惡化，但這種惡化并未伴隨炎癥因子及炎癥基因的過(guò)度表達(dá)。為此他們提出G-CSF或GM-CSF對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化并無(wú)益處，而有不良作用。國(guó)內(nèi)趙文燕等[9]應(yīng)用新西蘭雄性大白兔作的實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論則認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化損害內(nèi)皮，減少內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC），G-CSF對(duì)EPC有動(dòng)員作用，能夠增加外周血EPC數(shù)量，對(duì)血管有保護(hù)作用，抑制動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展。我們的研究發(fā)現(xiàn)G-CSF并未達(dá)到上述治療作用，反而使斑塊面積加大，內(nèi)膜增厚，內(nèi)皮細(xì)胞變形，凋亡增加。這可能與用藥劑量及給藥方式有關(guān)。間隔使用G-CSF使機(jī)體一直處于應(yīng)激狀態(tài)，其產(chǎn)生的有害作用反而超過(guò)了促EPC增殖的益處。而中低劑量連續(xù)使用機(jī)體可能迅速適應(yīng)，其增加EPC數(shù)量，保護(hù)內(nèi)皮，刺激血管新生的良好作用就掩蓋了上述可能的不良反應(yīng)。另外，物種的差異也可能是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果截然不同的一個(gè)重要原因。有關(guān)機(jī)制需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

血脂異常是動(dòng)脈粥樣硬化形成因素中的重要一項(xiàng)，參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的多個(gè)環(huán)節(jié)，機(jī)制復(fù)雜。一般人們認(rèn)為G-CSF是骨髓干細(xì)胞的強(qiáng)有力的動(dòng)員劑，與各項(xiàng)血脂水平并無(wú)關(guān)系。但我們的研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用G-CSF可以使動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中最重要的血脂指標(biāo)TC與LDL高峰提前，并出現(xiàn)雙峰樣改變，而單高脂喂養(yǎng)須歷時(shí)6周以上才使這2項(xiàng)指標(biāo)以及AI與正常對(duì)照具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。G-CSF整整使之提前2周，但8周以后兩組均進(jìn)入平臺(tái)期，這可能與動(dòng)脈粥樣硬化已經(jīng)形成有關(guān)。眾所周知，高脂血癥能夠損害EPC，進(jìn)而影響內(nèi)皮細(xì)胞并導(dǎo)致其功能障礙，從而誘發(fā)血管病變，其中恰恰是TC、LDL扮演重要角色。我們發(fā)現(xiàn)此過(guò)程中TG并無(wú)明顯變化，這正證明了我們的觀點(diǎn)，即G-CSF對(duì)血脂存在一定影響，且以TC、LDL為主，對(duì)TG作用不大。G-CSF對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化可能的惡化作用，也許就與刺激TC、LDL等有害因子分泌有關(guān)。G-CSF應(yīng)用不當(dāng)可以加速動(dòng)脈粥樣硬化的形成，但單用GCSF并未能對(duì)血脂造成顯著影響，說(shuō)明造成血脂異常的主要因素還在高脂喂養(yǎng)，G-CSF只有在此基礎(chǔ)

上才能發(fā)揮作用。這提示我們對(duì)血脂尚正常的年輕患者，G-CSF可能還是安全的。

血管基質(zhì)的變化與動(dòng)脈粥樣硬化有重要關(guān)系，如Feldman等[10]很早就發(fā)現(xiàn)在高脂喂養(yǎng)兔中支架置入與球囊擴(kuò)張可以引起MMP表達(dá)差異。同時(shí)有實(shí)驗(yàn)也已證實(shí)G-CSF對(duì)MMP存在較大作用[11-12]，那么G-CSF是否通過(guò)對(duì)基質(zhì)的影響參與AS的形成，對(duì)此我們進(jìn)行了初步探討。由于實(shí)驗(yàn)方法的局限及樣本量的關(guān)系，我們采用免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)GCSF能引起基質(zhì)金屬蛋白酶的變化，但兩高脂喂養(yǎng)組之間差異并未達(dá)到顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這有待于我們?cè)谙乱徊降膶?shí)驗(yàn)中擴(kuò)大樣本量，應(yīng)用免疫印跡、PCR等分子生物學(xué)方法進(jìn)步證實(shí)。

總之，對(duì)于G-CSF在動(dòng)脈粥樣硬化等血管性疾病中的研究，今天還只是開(kāi)頭，還有很多機(jī)制方面的問(wèn)題需要人們?nèi)ド钊肓私?。隨著它在心血管疾病中的逐步應(yīng)用，這項(xiàng)任務(wù)就更顯緊迫與艱巨。

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The influence on atherosclerosis of hyperglycemia rabbit by G-CSF

HU Zhaohui1，MA Xiaoping2，LI Yuanmin3，LI Lei2，LIU Ruhui1，XU Wenjun1，YANG Ming1，JIANG Jinfa1
1.Department of Cardiology，Tongji Hospital，Tongji University School of Medicine，Tongji University，Shanghai 200065，China；
2.Department of Ophthalmology，Zhongshan Hospital of Fudan University，Shanghai 200032，China；
3.Department Cardiovascular，Affiliated Hospital of Taishan Medical College，Tan'an 271000，China

Objective Inorder to give reference for clinic application，we investigated the influence on atherosclerosis of hyperglycemia rabbit by granulocyto colony-stimulating factor（G-CSF）.MethodsThirty New Zeeland healthy male rabbits were divided into 4 groups randomly，whose blood was drew from the ear vein weekly to test the change of total cholesterol（TC），triglyceride（TG），high density lipoprotein（HDL），low density lipoprotein（LDL）.After sacrifice，the aorta thoracicalis was taken to make the SudaneseⅢfat dye，conventional hematoxylin and eosin（HE）dye as well as scanning electron microscope to observate the form change of endothelial cells，gruel type mottling and fat foam.Meanwhile immunohisto chemical IHC of matrix metallopeptidase 9（MMP9）and tissue inhibitor of metalloproteinase 2（TIMP2）was used to explorate the maitrix，and many datas of pathology were calculated by Leica QwinV3 image analysis system.Results Fed with high fat food，the level of blood fat such as TC，LDL and so on can rise to peak in 6 weeks，then go down to stable platform period after 8 week.G-CSF can make the fat curve appear double-peak，and the statistics difference of TC，LDL arrives 2 weeks earlier，contrast to the control group(P＜0.05).But it had no effect on TG.Adding G-CSF to ordinary fed group can make those blood fat have some fluctuation but can't get the significant deviation.The analysis by pathology also found G-CSF can increase the plaque area，endomembrane thickness，and the express of MMP9/ TIMP2.However only the former index won statistics significance between the 2 groups fed with fat.The scans electron microscope found the fragments of endothelial cell increases obviously when atherosclerosis appeared，shrinks in shape，so the same point was surported.Conclusion G-CSF has certain effect on the endothelial cell shape，and stimulate the blood fats level，primarily TC，LDL.For this reason it can aggravate atherosclerosis.The mechanism maybe related to maitrix but need further verification.

Atherosclerosis；High fat feed；G-CSF；Rabbit

R541

A

2095-378X（2014）04-0230-06

胡朝暉(1975—)，男，浙江瑞安人，副主任醫(yī)師，從事心血管內(nèi)科。

蔣金法（1958—），主任醫(yī)師；電子信箱：jiangjinfa83 @163.com